鱼类干细胞育种技术回顾与展望

专利申请首选集群智慧云企服，全网冰点价，代写全部资料，零操心拿专利证书。微信：543646

鱼类作为人类优质动物蛋白的重要来源，在满足不断增长的食物和营养需求方面占重要地位，其中海水鱼类因富含长链多不饱和脂肪酸、维生素和微量元素对人类健康尤为重要。然而，目前能进行规模化养殖的鱼类品种非常有限，并且在长期的养殖中面临着种质退化等问题，因此，运用现代生物技术创制养殖鱼类新种质、培育养殖鱼类优质品种是鱼类养殖业的迫切需求。

品种改良是促进水产养殖业发展的主要手段之一ꎮ 传统鱼类品种改良的方法主要为选择育种、杂交育种、染色体组操作及性控育种等ꎮ 近年来ꎬ分子标记辅助育种、全基因组选择、转基因及基因编辑育种和细胞工程育种等现代生物育种技术发展迅速 ꎮ 选择育种是指对具有优良性状的个体进行选择和培育ꎬ并辅以功能基因相关的分子标记进行选择 ꎬ但经多代选择后近交衰退现象明显ꎬ严重影响育种效率ꎮ 杂交育种是育种的另一重要方法ꎬ２０ 世纪 ５０ 年代开始在鱼类中广泛应用ꎬ通过种间杂交培育了众多养殖新品系 ꎬ但鱼类杂交育种仍存在工作量大、周期长等局限 ꎮ 基因编辑技术为鱼类育种提供了新的技术手段ꎬ已应用于多种鱼类品系的培育ꎬ包括虹鳟、草、鲤、尼罗罗非鱼和金头鲷等 ꎬ具有广阔的发展前景ꎮ

细胞工程育种是在细胞或染色体组水平上进行遗传改良的育种技术 ꎬ主要包括多倍体育种、细胞核移植、干细胞和单性生殖等ꎮ 其中ꎬ多倍体育种和单性生殖在鱼类育种中取得了令人瞩目的成就 ꎮ 近年来ꎬ干细胞技术快速发展ꎬ本文主要对鱼类干细胞诱导和移植技术的研究进展及在育种中的应用进行了综述ꎬ总结了鱼类干细胞育种技术面临的问题ꎬ并对其发展前景进行了展望ꎬ旨在为鱼类育种技术研究提供参考ꎮ

１　鱼类干细胞

干细胞是在一定条件下具有无限自我更新和发育潜能的一类细胞ꎬ根据其来源大致可分为胚胎干细胞(ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌꎬ ＥＳＣ)和成体干细胞(ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌꎬ ＡＳＣ)ꎮ 自小鼠 ＥＳＣ 培养成功以来 ꎬ哺乳动物干细胞在基础和应用研究方面都取得了一系列重大成就ꎮ 比较而言ꎬ低等脊椎动物干细胞研究起步较晚ꎬ始于模式动物斑马鱼和日本青鳉 ＥＳＣ 的培养 ꎮ 自 Ｈｏｎｇ 等 在青鳉中建立无滋养干细胞培养体系后ꎬ干细胞培养技术在多种鱼类中获得成功 ꎬ这些工作为鱼类干细胞的深入研究奠定了基础ꎮ 先后建立的半克隆(ｓｅｍｉ￣ｃｌｏｎｉｎｇ)、干细胞移植及诱导等干细胞操作技术显示出鱼类干细胞在动物克隆和良种培育等方面具有重要的应用价值ꎮ

２　鱼类干细胞移植及应用

２.１　胚胎干细胞移植

胚胎干细胞具有发育多能性ꎬ一定条件下ꎬ在体内、体外均可分化为包括生殖细胞在内的多种细胞类型ꎮ 细胞移植是诱导干细胞体内分化研究的常用方法ꎮ 在鱼类中ꎬＷａｋａｍａｔｓｕ 等 使用青鳉囊胚细胞建立了鱼类细胞移植形成嵌合体的方法ꎮ 随后 Ｈｏｎｇ 等 将长期培养的青鳉 ＥＳＣ 移植到囊胚ꎬ发现供体细胞能参与受体胚胎多种组织器官的分化ꎬ但未能像小鼠 ＥＳＣ 那样实现供体细胞的生殖系传递ꎮ 尽管 Ｍａ 等 [２０] 使用短期培养的斑马鱼胚胎细胞成功获得生殖系嵌合体ꎬ但鱼类长期培养 ＥＳＣ 的有效生殖系传递仍然存在技术瓶颈ꎮ

细胞核移植是获得供体细胞来源后代个体的另一方法ꎬ即将供体细胞核通过显微操作方法移植到同种或异种动物的成熟卵子中以获得后代个体ꎮ 早在 ６０ 年代ꎬ童第周等 开创了鱼类核移植研究先河ꎬ在金鱼和鳑鱼中证明了鱼类细胞核移植的可行性ꎮ １９８０ 年ꎬ中国科学家以鲤鱼细胞核和鲫鱼细胞质配合培育出核质杂种鱼ꎬ成为世界上第一条克隆鱼ꎬ也是第一例可发育成熟的异种间胚胎细胞克隆动物 ꎮ １９８６ 年ꎬ我国首次报道体细胞克隆动物的形成ꎬ证实成年鲫鱼的体细胞可以去分化和再程序化ꎬ具有发育成个体的全能性 ꎮ 此后ꎬ核移植技术广泛应用于核质杂种克隆鱼研究ꎬ为鱼类核质关系研究和鱼类品种改良的发展做出了重要贡献 ꎮ 鱼类细胞核移植技术多用于未培养细胞或短期培养细胞ꎮ 对于长期培养细胞的核移植尚有局限性ꎬ特别是随着鱼类基因组编辑技术的发展ꎬ长期培养细胞的核移植研究更有意义ꎮ Ｌｅｅ 等 将培养 １２~２６ 周斑马鱼细胞的细胞核移植到去核卵母细胞中ꎬ得到可成活的二倍体后代ꎮ Ｙｉ 等 在青鳉中成功培养了单倍体 ＥＳＣꎬ并将稳定表达荧光标记的细胞核植入成熟卵母细胞中ꎬ获得首例可育半克隆(ｓｅｍｉ￣ｃｌｏｎｅｄ)鱼 Ｈｏｌｌｙꎬ其二倍基因组来源于两个不同个体ꎬ类似于有性生殖产生的后代ꎮ 因此ꎬＥＳＣ 培养ꎬ特别是单倍体 ＥＳＣ 培养ꎬ结合核移植及基因组编辑等技术是鱼类优良种质创制的重要途径ꎮ

２.２　原始生殖细胞移植

鱼类原始生殖细胞 ( ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌꎬＰＧＣ)是雌雄配子的前体细胞ꎮ 脊椎动物 ＰＧＣ 移植产生供体细胞来源后代的实验最初在鸡中获得成功 ꎮ 在鱼类中ꎬＬｉｎ 等 将斑马鱼中囊胚卵裂球植入同一发育阶段的受体胚胎中ꎬ获得供体细胞来源的后代ꎬ表明供体细胞(含 ＰＧＣ 和体细胞)成功嵌入受体生殖系并分化为功能配子ꎮＴａｋｅｕｃｈｉ 等 用从养殖鱼类虹鳟早期性腺中分离的 ＰＧＣ 进行移植得到了类似结果ꎮ 种内 ＰＧＣ移植在泥鳅中也有尝试ꎬ其 ＰＧＣ 移植后产生生殖系嵌合体ꎬ嵌合率达 ２５％ꎬ且能够产生移植后代个体 ꎮ 在种间移植中ꎬＹａｍａｈａ 等 将二倍体金鱼 ＰＧＣ 和体细胞的混合细胞移植到三倍体鲫鱼中ꎬ成功从嵌合体中获得了金鱼配子ꎮ 在种间单个 ＰＧＣ 移植中ꎬ不同属(金鱼移植到斑马鱼)和不同科(泥鳅移植到斑马鱼)间形成的嵌合体也可以产生供体细胞来源的配子 ꎮ 但在不同目或更 远 距 离 的 物 种 间ꎬ 如 日 本 鳗 ( Ａｎｇｕｉｌｌａｊａｐｏｎｉｃａ) 到斑马鱼 、鲟(ｇｅｎｕｓ Ａｃｉｐｅｎｓｅｒ) 到金鱼 之间ꎬ虽能以较低成功率形成生殖嵌合体ꎬ却不能产生供体细胞配子ꎮ 因此ꎬ在鱼类中ꎬ无论是种内还是种间ꎬ通过 ＰＧＣ 移植获得供体细胞物种来源的配子切实可行ꎮ 但由于鱼类胚胎中ＰＧＣ 数量有限ꎬ该方法的广泛使用ꎬ特别是在养殖鱼类中的使用存在一定局限ꎮ

２.３　生殖干细胞移植

原始生殖细胞经过有丝分裂形成精原细胞(ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａ)或卵原细胞(ｏｏｇｏｎｉａ)ꎮ 作为生殖干细胞ꎬ精原细胞也可以作为细胞移植技术的供体细胞ꎮ 将小鼠供体精原细胞移植到不育小鼠的性腺中ꎬ 可产生具有供体遗传特征的可育精子 ꎮ 精原细胞由于数量多ꎬ且易于分离和纯化ꎬ已成为生殖干细胞移植的主要细胞类型ꎮ 在鱼类中ꎬ将包含精原干细胞(ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａｌ ｓｔｅｍｃｅｌｌꎬ ＳＳＣ)的虹鳟精巢细胞分别移植到刚孵化的雌性和雄性胚胎中ꎬ雌雄嵌合体可分别形成源于供体细胞的成熟精子和卵细胞ꎬ表明 ＳＳＣ 在受体胚胎中具有类似 ＰＧＣ 的分化能力ꎬ并且其分化的配子类型取决于受体胚胎的性别表型 ꎮ 在种间移植中ꎬＯｋｕｔｓｕ 等 将虹鳟的精巢细胞移植入马苏鲑鱼(Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍａｓｏｕ)中ꎬ性成熟嵌合体成功产生虹鳟功能配子ꎮ 这些实验表明无论种间还是种内ꎬ移植的精原细胞均可产生可育配子ꎮ随后ꎬ精原细胞移植研究在多种淡水和海水鱼类中展开ꎬ在种内和种间移植的嵌合体中均得到成熟精子或卵子ꎬ包括鲤 [３７] 、青鳉 和红鳍东方鲀(Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ)等模式和经济鱼类ꎮ 在种间移植中ꎬ随着供体与受体种类间的系统发育距离增大ꎬ特别是不同科或目间ꎬ生殖细胞的移植成功率大大降低ꎮ 但在淡水鱼中ꎬ精原细胞移植技术仍然可以在不同种和不同目间移植ꎬ例如泥鳅和斑 马 鱼 ( 科 间)、 克 林 雷 氏 鲶 ( Ｒｈａｍｄｉａｑｕｅｌｅｎ)和尼罗罗非鱼(Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ) (目间)等ꎮ 海水鱼类由于繁殖周期长、生长环境复杂ꎬ精原细胞的移植仅局限于科间ꎬ且移植的生殖细胞往往在受体内难以分化为成熟的功能性配子 ꎮ 最近ꎬ鲆类科间的精原细胞移植取得重要进展ꎬ中国科学院海洋研究所刘清华等将牙鲆、夏牙鲆和大菱鲆的冷冻精原细胞移植到三倍体牙鲆幼鱼体内ꎬ分别获得了 １００％、７５％~９５％和 ３３％~５０％的供体细胞嵌合率ꎬ并能够产生源于供体细胞的精子ꎬ成功繁育后代(未发表资料)ꎮ 除精原细胞外ꎬ鱼类卵原细胞也可用于移植ꎬＹｏｓｈｉｚａｋｉ等 报道ꎬ分离自 ６~９ 月龄虹鳟幼鱼的卵原细胞在两种性别的受体中都表现出良好的分化可塑性ꎬ在雌雄受体中分别分化为成熟卵子和精子ꎬ产生正常后代个体ꎮ

因此ꎬ生殖干细胞移植在鱼类育种中表现出育种时间短、效率高的显著优势ꎮ 但该技术操作难度大、技术体系尚未完全成熟以及在不同鱼类中应用的共性问题等需要进一步完善ꎮ

２.４　生殖干细胞移植操作过程及影响因素

生殖干细胞移植是一项近年发展起来并逐步完善的鱼类生殖操作新技术ꎬ其过程大致可归纳为三个主要步骤:(１) 供体细胞分离、纯化和鉴定ꎻ(２)受体准备ꎻ(３)细胞移植ꎮ 其中ꎬ提高细胞移植成功率的关键在于供体细胞时期的选择和移植受体的制备ꎮ

生殖干细胞可从幼鱼或成鱼性腺中通过机械和酶解等方法分离ꎮ 常用的细胞纯化方法包括密度梯度离心和流式分选等ꎮ 密度梯度离心的介质包括 Ｐｅｒｃｏｌｌ、Ｆｉｃｏｌｌ 和 ＢＳＡ 等 ꎮ 流式分选法多用于模式鱼类ꎬ通过表达荧光标记的生殖细胞标记基因(如 ｖａｓａ)启动子ꎬ借助流式细胞技术可有效分选荧光蛋白阳性细胞ꎬ从而达到纯化精原细胞的目的ꎮ 在经济鱼类中ꎬ可用生殖细胞表面蛋白ꎬ如虹鳟 Ｌｙ７５ 蛋白 和罗非鱼 Ｇｆｒａ１ 受体 等作为精原细胞的细胞表面标记ꎮ

生殖干细胞移植受体可以是胚胎、幼鱼或成鱼ꎮ 除受体与供体亲缘关系和繁殖周期等对生殖干细胞移植的成功率有显著影响外ꎬ受体育性也是影响生殖系嵌合体形成的重要因素ꎮ 移植操作中ꎬ合适发育时期的胚胎受体可以直接用于移植ꎬ若在移植前去除或减少受体胚胎生殖细胞ꎬ则可显著提高移植成功率ꎮ 目前ꎬ生殖细胞去除方法有化学处理、物理方法、遗传操作或组合处理ꎮ 白消安(ｂｕｓｕｌｆａｎ)可通过影响旺盛分裂的细胞去除性腺中的生殖细胞ꎮ Ｌａｃｅｒｄａ 等 使用白消安结合热处理罗非鱼成鱼约 １２ 周ꎬ成功去除精巢中的生殖细胞ꎮ 染色体组操作是另一种产生不育移植受体的方法ꎬ通过二倍体和四倍体个体杂交ꎬ或者在受精后对卵子用静水压和热休克等方法处理可产生不育三倍体个体 ꎮ 使用三倍体作为生殖干细胞移植受体在种内和种间移植都有成功的报道 ꎮ 另外ꎬ通过基因编辑技术敲除或敲降生殖细胞发育关键基因(如 ｄｅａｄ ｅｎｄ)抑制生殖细胞形成也是消除移植受体生殖细胞的有效方法 ꎮ

３　鱼类干细胞体外诱导和分化

３.１　胚胎干细胞诱导

ＥＳＣ 具有分化多能性ꎬ在体内和体外可分化为各种细胞类型ꎮ 小鼠 ＥＳＣ 可在体外诱导成ＰＧＣꎬ并分化为具有功能的精子和卵子 ꎮ 在鱼类中尽管也建立了多种海、淡水鱼的 ＥＳＣ 细胞系ꎬ但尚没有 ＥＳＣ 体外分化成生殖细胞的报道ꎬ因此ꎬ这是鱼类 ＥＳＣ 研究中亟需突破的技术瓶颈ꎮ

３.２　生殖干细胞培养和诱导分化

存在于性腺中的生殖干细胞维持着生物体生命周期中配子的发生和世代间遗传信息的传递ꎮ同 ＥＳＣ 一样ꎬ生殖干细胞在合适的条件下可以进行增殖和分化ꎮ 但相较于 ＥＳＣꎬＳＳＣ 培养技术发展较慢ꎬ主要由于 ＳＳＣ 在体外培养中难以成为长期稳定生长的细胞系ꎮ Ｈｏｎｇ 等 首次使用青鳉成鱼精巢建立精原干细胞系 ＳＧ３ꎬＳＧ３ 细胞能够在体外培养中长期稳定生长ꎬ在适当诱导条件下可进入减数分裂并产生活动精子ꎬ这是鱼类长期培养 ＳＳＣ 在体外分化为精子的唯一报道ꎮ 两年后ꎬＧｕａｎ 等 建立了小鼠 ＳＳＣ 细胞系ꎮ虽然鱼类长期稳定生长的 ＳＳＣ 细胞系数量有限ꎬ且缺乏分化为功能配子的能力ꎬ但通过诱导短期培养 ＳＳＣ 体外分化是配子形成的另一可行途径ꎮ Ｍｉｕｒａ 等 尝试了将日本鳗的精原细胞进行诱导ꎬ在精巢培养体系中用 １１￣酮基睾酮诱导成熟精巢中的 Ａ 型和早期 Ｂ 型精原细胞进入减数分裂ꎬ形成精子ꎮ 采用类似的诱导策略ꎬ精子体外诱导在罗非鱼 和青鳉 中也得以成功实现ꎮ 这些体外诱导的精子不论是否具有受精能力都表明诱导鱼类 ＳＳＣ 分化为精子是可行的ꎮ２００２ 年ꎬＳａｋａｉ 等 在以 Ｓｅｒｔｏｌｉ 细胞作为饲养层的培养体系中ꎬ将从斑马鱼精巢中分离的精原细胞诱导分化为功能精子ꎬ且通过人工受精获得正常胚胎ꎮ 随着近年来体外诱导系统的优化ꎬ目前已在多种经济鱼类中实现了可育精子的诱导ꎬ如胡子鲶 、南亚野鲮 和虹鳟等ꎮ 鱼类体外精子诱导体系的建立和优化ꎬ为缩短鱼类育种周期提供了技术支撑ꎮ

３.３　影响生殖干细胞诱导效率的因素

鱼类生殖干细胞体外成功诱导主要取决于两个关键因素:细胞因子和培养微环境ꎮ 细胞因子可以显著促进和提高精原细胞的诱导效率ꎮ 在鳗鱼精原细胞体外分化中ꎬ１１￣酮基睾酮的诱导作用至关重要 ꎮ 内皮细胞生长因子是另一类 ＳＳＣ分化促进因子ꎬＬｉｆ、Ｆｇｆ２ 和 Ｇｄｎｆ 等能够显著提高斑马鱼生殖细胞存活率和维持生殖细胞特性 ꎮ

研究表明ꎬ胰岛素样生长因子和人绒毛膜促性腺激素也有促进精原细胞增殖的作用 ꎮ 随着研究的不断开展ꎬ将有更多更有效的细胞因子被发现ꎮ

生殖干细胞的体外分化依赖于特定的微环境ꎮ 在斑马鱼精原细胞分化中ꎬ源于精巢的饲养细胞肿瘤样细胞 ＺｔＡ６ 或 Ｓｅｒｔｏｌｉ 细胞表达 ｓｏｘ９ａ等因子维持细胞分化的微环境 ꎮ 此外ꎬ培养诱导体系的空间结构也影响细胞分化效率ꎬ在培养

系统中模拟体内精巢的囊性结构可显著提高精子的形成效率ꎮ Ｈｉｇａｋｉ 等 [５９] 研究了濒危鱼类暗斑颌须(Ｇｎａｔｈｏｐｏｇｏｎ ｃａｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ)精原细胞的体外分化ꎬ发现 ３Ｄ 培养体系的诱导效率显著高于 ２Ｄ体系ꎮ 目前ꎬ有各种商业化 ３Ｄ 培养系统可用于细胞培养ꎮ 近期ꎬ我们采用 ３Ｄ ｔｒａｎｓ￣ｗｅｌｌ(ＢＤ)为基础支架建立 ３Ｄ 细胞培养体系ꎬ诱导海水鱼中华乌塘鳢生殖干细胞分化ꎬ取得了良好效果ꎬ诱导

３０ ｄ 后可产生大量可育精子ꎬ并能以较高效率授卵母细胞ꎮ 将该诱导系统用于淡水鱼斑鳢和草鱼ꎬ同样成功诱导出有运动能力的精子(未发表资料)ꎮ

４　展望

鱼类主要通过有性生殖繁衍后代ꎮ 受精卵经胚胎发育形成个体ꎬ个体生长到一定阶段达到性成熟ꎬ产生生殖细胞ꎬ繁育后代ꎮ 不同种类的鱼繁殖周期存在较大差异ꎬ通常从一年到几年甚至十几年ꎮ 经济鱼类的繁殖周期一般较长ꎬ无论是通过选育法还是杂交法ꎬ新品种的培育往往均需要花费很长时间ꎮ 生殖干细胞移植和诱导等生殖细胞操作技术能大大缩短配子形成时间ꎬ加快育种进程ꎬ同时也便于基因操作ꎬ因此在经济鱼类育种中具有较高的应用价值ꎮ 然而ꎬ生殖细胞操作技术研究虽然在近年来取得了较大进展ꎬ但有一些关键问题亟待解决:①无论是生殖干细胞体外诱导还是移植嵌合体体内分化ꎬ其效率均偏低ꎮ 如何针对特定种类ꎬ提高功能配子的产生效率ꎬ仍然存在技术挑战ꎻ②鱼类种类繁多ꎬ其生殖和生理特性多种多样ꎮ 在生殖细胞移植中ꎬ不同目、科、属和种的鱼类间存在细胞排异现象ꎬ使供体细胞和受体鱼种类的选择受到限制ꎮ 如能突破亲缘关系的局限ꎬ即可扩大受体选择范围ꎬ特别是选择繁育周期短的鱼类作为受体则可显著提高移植成功率ꎻ③生殖细胞诱导和移植技术目前只在为数不多的鱼类中取得成功ꎬ尤其是在大宗养殖鱼类中的研究较少ꎮ 同时ꎬ用于每种鱼类的移植和诱导体系各有差异ꎬ而同一体系用于不同鱼类所产生的效果也差别较大ꎮ 如用于中华乌塘鳢的 ３Ｄ 诱导体系ꎬ应用于斑鳢时可较高效率地产生精子ꎬ但用于草鱼时则产生较多形态不正常的精子ꎮ 因此生殖细胞操作应用于各种鱼类的技术共性还有待突破ꎮ 这需要在更多更有代表性的鱼类中广泛开展研究ꎬ积累总结共性技术的基础资料和经验ꎻ

④生殖细胞操作与其它现代育种技术结合不够紧密ꎮ 基因编辑技术育种和分子标记辅助育种等是现代鱼类育种的发展趋势 ꎬ生殖细胞操作技术研究应加强与这些育种方法的结合ꎮ 同时ꎬ干细胞培养和体外诱导技术的发展也为基因编辑技术用于鱼类新种质的快速创制创造了条件ꎮ 总之ꎬ在鱼类干细胞育种技术研究中ꎬ应着重这些问题的解决ꎮ 随着鱼类干细胞操作技术的发展ꎬ将其与基因和基因组操作技术相结合ꎬ通过创制优质“试管配子”以培养鱼类新品种将成为重要育种方法ꎬ极大地促进养殖鱼类种业的发展ꎮ