鱼类(生物工程鲫)的三倍体诱导杂交育种

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自孟德尔1865发表《植物杂交试验》和他的遗传定律得到公认以后，100多年来选种、有性杂交就成了动植物遗传育种的基本手段。例如：种内品种之间杂交产生的丰鲤、芙蓉鲤，不同属间的远缘杂交产生的湘鲫等，都表现出了明显的杂种优势，并在生产上得到了应用，获得了显著的经济效益。

(丰鲤是由中科院水生所选育，以兴国红鲤为母本、散鳞镜鲤为交本，通过杂交而获得的杂种一代，是我国最早研究成功并最先在生产上获得推广应用的杂交鲤)

但是，这一传统方法也存在着明显的局限性，如世代周期长，产生的子二代性状分离等。以丰鲤为例，在应用几年以后，由于经营管理不善，对杂交组合的亲本没有建立严格的管理制度，亲本不纯导致杂种优势衰退的现象已十分普遍。

为解决这些问题，国内外学者开始致力于生物技术应用于鱼类育种的研究，近年来研究十分活跃的三倍体诱导技术就是其中之一，并已取得一些显著的成果。

目前，三倍体诱导杂交育种多用于改良鲫鱼种类，所以，简称为生物工程鲫或三倍体鲫鱼。比如：湘云鲫、芙蓉鲫、黄金鲫等等诸多品种。

(湘云鲫)

1．三倍体育种的意义

从细胞遗传学角度来看，三倍体是非偶数染色体组，故阻碍了生殖细胞正常的减数分裂，结果常常导致性腺不能发育。

在杂交三倍体，即种间杂交受精卵通过三倍体诱导技术处理而培育出的三倍体，其不育性更高于普通三倍体。

不育的三倍体经济鱼类因为没有性成熟阶段性腺发育的能量损耗，所以有以下优点：

1.避免了性腺发育阶段和产卵季节鱼肉质量下降并延长了上市时间；

2.避免了性腺发育阶段的生长停滞和死亡率增加；

3.缩短了养殖周期，减少了养殖成本并可养成大型个体。

利用三倍体鱼类不育性的优点，人们可以达到这样的目的：

①获得生长速度较快的三倍体品种，提高鱼类养殖的经济效益；

②控制养殖鱼类的过速繁殖和防止对天然资源的干扰。

此外，有些种间杂交二倍体的生存率非常低，甚至不能成活，但杂交三倍体都能恢复生存性。这一特点大大提高了杂交三倍体的实用价值，这样就可以通过诱导杂交三倍体来组合二倍体杂交不成功的两个种类间的优良性状，如抗病性、温度耐受性、快速生长等。

2．三倍体产生的生物学原理

(1)、正常二倍体鱼的形成

除少数种类外，自然界绝大部分鱼类是以二倍体形式存在的，并以两性融合的方式繁殖后代，需要人工诱导才能产生三倍体。

(二倍体鲫鱼---方正银鲫)

二倍体鲫鱼，即普通的良种鲫鱼，如：方正银鲫、彭泽鲫等等诸多品种，体形体色多受大众喜爱。

鱼类染色体的特点之一，是具有较大的可塑性，易于加倍，可使单倍体形成二倍体，再由二倍体形成多倍体，这是人工诱导三倍体技术方法的理论基础。

对二倍体鱼来讲，成熟卵处于第二次减数分裂的中期，此时存在着2组染色体，当具有1组染色体的精子入卵后，刺激卵子继续完成第二次减数分裂，卵中原有的2组染色体中的1组作为第二极体排出卵外，留在卵内的1组染色体和精子带入的1组染色体结合，则受精卵成为正常的二倍体开始发育。

(2)、直接获得三倍体鱼的方法

如果在精子入卵而第二极体尚未外排之时，对受精卵进行高温、低温、高压或化学药物等处理，阻止第二次减数分裂的进行，第二极体就不能排出卵外，则诱导产生出具有3组染色体的个体，称之为人工诱导三倍体。

这种染色体组的组合方式是二组染色体来源于母本，一组染色体来源于父本。

(二倍体鲫鱼---彭泽鲫)

减数分裂的阻止是通过破坏纺锤丝而使染色体无法分离而使核分裂停止，或是通过阻碍细胞表层收缩环、沟的形成而使细胞质分裂停止的方法而实现的，可以阻止第二次减数分裂，形成三倍体受精卵，进而发育成三倍体鱼。

温度、压力和咖啡因等处理属于前者，而细胞松弛素B处理则属后者。

3．人工诱导三倍体的方法

用人工的方法获得三倍体可通过两条途径。

一条是直接途径，即用物理或化学的方法对受精卵进行处理，阻碍第二极体外排。

另一条是间接途径，即首先诱导获得四倍体，待四倍体个体性成熟后再与二倍体个体自然交配，获得三倍体。

从理论上讲，第二条途径有其优越之处，一旦获得四倍体个体后，就不需要再进行物理或化学诱导，避免了诱导过程对胚胎的损伤。

如果能建立稳定的四倍体品系，获得三倍体就变成一件非常容易的事情了。但目前人工诱导的三倍体绝大部分是采用第一条途径获得的，这是因为阻止第二极体外排的方法比较成熟。

四倍体的诱导是阻止第一次卵裂，这比诱导三倍体要困难得多，成功率很低，只在少数鱼类如虹蹲和鲫，获得过性成熟的四倍体。

(芙蓉鲤鲫)

鱼类人工诱导三倍体的方法可以分为物理学、化学和生物学方法3个方面：

（1）物理学方法

温度休克和静水压休克是目前人工诱导三倍体鱼最常用的物理学方法，温度休克又可分为热休克和冷休克两种。

大多数鱼类在精子入卵后8～10分钟，就可完成第二次减数分裂，排出第二极体，45～50分钟就可完成第一次有丝分裂。

如需获得三倍体，就要在完成第二次减数分裂以前进行诱导处理；如需获得四倍体，则必须抑制第一次有丝分裂。

无论采用哪一种方法诱导，都必须严格控制处理的起始时间和持续时间。

如：美洲红点鲑，卵受精后15分钟用28℃高水温热休克处理10分钟，诱导出100％的三倍体，孵化率为42％。

对胡子鲶而言，在25±1℃下卵受精5分钟后，放人5℃海水冷休克处理1小时，然后放入充气海水中培育，结果获得100％的三倍体仔鱼，如果处理时间在1.5小时以上，则造成100％的死亡率。

用静水压诱导同样也需要严格掌握处理时间。

以水晶彩鲫为例，受精卵的压力敏感期仅仅在受精后4～5分钟，在此之前为卵子启动期，施加压力会破坏卵子的激动和修整过程，造成发育受阻。其后为压力不应期，此时第二次减数分裂趋于明朗，压力对保留第二极体体失去作用。

因此，为了获得三倍体水晶彩鲫，静水压诱导只能在受精后4～5分钟进行。

（2）化学方法

用秋水仙素、细胞松弛素B等化学药品在适当时刻处理鱼类受精卵，可以抑制第二极体外排或抑制第一次有丝分裂．从而达到产生三倍体或四倍体的目的。

应用这一方法在国内外都有成功的实验报道，但由于这些化学物品价格较贵，且有毒性，故很少在生产上应用。

（3）生物学方法

通过鱼类远缘杂交，异源精子可以诱发受精卵产生多倍体，这种由于远缘杂交染色体自然加倍的现象，称为生物学方法。

利用这一方法可以获得三倍体和四倍体鱼类。

如：鲫（♀）×鲤（♂）杂交的杂种二代（F2）是二倍体，F2（♀）×F2（♂）自交后产生的F3是四倍体，往后的F4、F5乃至F6都是四倍体，已经形成了稳定的四倍体种群。

利用这一四倍体种群与二倍体鱼杂交，可以获得具生长优势的三倍体鲤鱼和三倍体鲫鱼。

(黄金鲫)

经过实验处理以后产生的个体是否是真正的三倍体或四倍体，还需要通过严格的鉴定。

常用的鉴定方法有以下三种：

（l）染色体计数和核型分析，这是最基本而且可靠的方法。

（2）红细胞或红细胞核大小测量，这一方法的理论依据是染色体数目倍增，细胞（核）体积也随着变大，该法最大的优点是简便、快速。

（3）DNA含量测定，普通三倍体细胞的DNA含量是二倍体的1．5倍，四倍体细胞的DNA含量是二倍体的2倍。

通过DNA含量的测量可以确定细胞的染色体倍数。

(先科巨鲫)

4．研究现状及前景

三倍体育种的主要目的是利用其不育性这一特点。经过各国科学家的不懈努力，已先后获得了多种鱼类的三倍体，如草鱼、鲤、鲫、虹蹲、香鱼、罗非鱼、鲑、黑绸、胡子鳃、泥鳅、牙鲆等，在草鱼、虹蹲、香鱼等部分鱼类已达到了批量生产的水平。

在研究中也发现，有些鱼类的三倍体雄性精巢发育，达不到预期不育的目的。如在人工培育的三倍体与自然二倍体香鱼混合存在的场合下，三倍体雌鱼完全没有产卵行为，但三倍体雄鱼与二倍体雄鱼类似，出现第二性征，产生精子，有追尾现象。如果把人工培育的三倍体香鱼放流到自然河川中，会影响天然二倍体香鱼的繁殖。

为此，结合雌核发育、性别转变和三倍体诱导技术培育全雌三倍体鱼成为科学家研究的新领域。其方法是先通过雌核发育技术培育出全雌二倍体鱼；再用雄性激素处理全雌二倍体鱼，诱导出基因型不变、表型改变的生理雄性鱼；这种雄鱼与普通雌鱼交配得到的受精卵，经三倍体诱导，就可获得全是雌性的三倍体个体。

目前，这一技术在培育全雌三倍体虹鳟和降海型马苏大麻哈鱼上已达到了实用化水平。

既能提高经济效益，又能避免对天然资源的干扰，这是三倍体育种在基因工程技术不断向鱼类育种领域渗透的今天，仍具有强大生命力的主要因素之一。

综观已有的研究成果，如果进一步优化三倍体诱导的处理条件，提高鱼苗的成活率，将会有更多的三倍体鱼类在水产养殖业中应用。

（生物学通报，1996年第11期，文字有删减）