鱼类育种学概述

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鱼类育种的途径和范围是非常广泛的，包括常规的选择育种、杂交育种、多倍体育种以及新近发展起来的细胞工程育种和转基因育种。本文就这些方面对鱼类的育种进行综述。

鱼类育种是对野生或现有品种进行遗传改造，创造自然界所未有的鱼类新品种，是对鱼类多样性和物种进化的贡献。20世纪70年代以后，鱼类育种与细胞工程和基因工程等新高生物技术的结合，使这一研究领域很快出现生机，冲破了多年来常规的选择育种和杂交育种在育种多样性和快速高效等方面的制约。我国较大规模开展鱼类遗传育种研究的历史仅有20多年。短短20多年来，不但在育种技术方面取得了重大进步，建立了杂交、倍性、细胞工程以及基因工程等多种育种技术，并逐渐形成了多种技术综合配套的技术路线。通过传统的育种技术和现代的育种技术成功地培育出新的鱼类品种，如工程鲫、工程鲤等，不断向社会推出了许多具有重要经济价值的养殖新对象，大大提高了鱼类的生产力，丰富了鱼类的遗传多样性。鱼类遗传多样性的丰富反过来又可增加鱼类生产量和改良鱼类品种，因此，保护基因多样性和可持续的利用是人类维持基本的生命过程和生命支持系统的基础。

 1 选择育种

 选择育种是育种工作的一个最基本的手段。改变育种对象遗传性质的常规方法有两种：一是挑选作为亲本用的个体，这就是选择。另一个是控制亲本的交配方式，这就是遗传操作。在鱼类生长发育的各个阶段，可以有目的地选择具有优良性状的个体，淘汰品质不良的个体，这种方法可以避免由于鱼类人工繁殖所产生的近亲交配而随之引起的退化现象。目前，系统选育的方法通常有4种：(1)混合选种(又称集团选种) ，即从生产效果最好的池塘中选出鱼群，这种方法在鱼类的各个发育阶段都可进行；(2)家系选种(又称窝选) ，即从一雌一雄选亲配合建立家系开始，在其后代中一代一代进行高度的近亲交配，以累代实行严格的全同胞交配为基础，依据个体表型值，兼顾家系平均值，进行选择留种；(3)亲本选种，又称后裔鉴定选种，即根据后代质量而对亲本作出评价的个体选择方法，根据后裔鉴定结果决定对亲本的取舍；(4)综合选种，即综合上述几种选种方法进行的选择育。

 2 杂交选育杂交选育就是将分类地位在两个不同品种以上或种以上两个亲本个体之间的交配，分为种内杂交和远缘杂交。鱼类杂交的目的是利用杂交优势以产生所需的养殖新品种。我国是鲤鱼品种最丰富的国家，20世纪70年代开始就已把鲤鱼品种间的杂交优势用于生产实践。目前已进行过112个组合的杂交，包括3个目，5个科，32个种，其中以鲤品种间杂交效果为好，，如丰鲤、荷元鲤、岳鲤、芙蓉鲤和三杂交鲤等已通过鉴定并在生产上推广应用。相对而言，鱼类选育要比农作物选育要困难得多。主要是由于鱼类生殖周期长、生活在水中、容易混杂以及不便观察等客观条件的限制和影响。尽管如此，我国在鱼类选育方面仍进行了大量 工作，尤其是在人工繁殖技术成功之后，杂交育种在我国淡水养殖鱼类中广泛开展，获得了一大批杂交鱼新品种。

 3 单倍体育种

单倍体育种鱼类的单倍体育种包括人工诱导雌核发育和人工诱导雄核发育两个方面。我国的鱼类人工雌核发育是70年代从淡水鱼开始的．至于诱导雄核发育的研究，国内外都处于初步阶段。鱼类人工雌核发育的原理就是模拟天然雌核发育原理，用遗传物质失活的精子去与成熟卵子“受精”，激活卵子发育，并通过诱导使卵子染色体加倍而发育成个体。人工雌核发育不仅能产生单性的后代，且能迅速建立纯系，对于鱼类杂种优势利用，选育种及育种基础理论的研究皆有重要的意义。近二十年来，我国在鱼类雌核发育的研究方面取得了骄人成绩。已弄清了鱼类天然雌核发育的机理，包括雌核发育鱼类个体特征、细胞学、遗传学、生物化学、免疫学、种群生物学等方面的基础。人工诱导鱼类雌核发育已在鲫、红鲫、兴国红鲤、荷包红鲤、草鱼、鲢鱼、杂交鲤和建鲤等鱼类上获得成功。利用天然雌核发育的方正银鲫与兴国红鲤雄鱼。

 4 多倍体育种

 多倍体是指体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体。世界上已研究过染色体的1100余种鱼类中，至少有60多种多倍体。多倍体鱼类对控制过度繁殖、提高生长速度、延长寿命和改善鱼肉质等都有效果诱导鱼类多倍体的原理与人工诱导雌核发育有相似之处，主要是利用理化因素破坏纺缍丝、抑制极体的排出或抑制卵裂的进行，从而形成三倍体或四倍体鱼类。远缘杂交也能产生多倍体鱼类。我国在淡水鱼类的多倍体育种中进行了不懈的摸索。主要采用了温差处理、水压处理、药品处理和种间杂交方法获得多倍体目前已报导的多倍体(三倍体和四倍体) 鱼有：草鱼、鲢鱼、鳙鱼、团头鲂、荷包红鲤、、兴国红鲤×草鱼、荷包红鲤×白鲫、草鱼×团头鲂、白鲫×红鲫、草鱼×鳙鱼、草鱼×三角鲂等。其中荷包红鲤×白鲫已被证。

 4.1 三倍体产生的生物学原理

 一般来说，大多数鱼类为二倍体(2n)，体细胞中含有3个以上染色体组的则称为多倍体。在鱼类中研究最多的就是三倍体。人工三倍体的诱导可以通过保留受精卵第二极体来现。鱼卵成熟排出体外，精子进入鱼卵，卵子正处于第二次减数分裂的中期，精子入卵数分钟后即放出第二极体。如果以某种措施抑制第二极体的外排，受精卵中就保留了两套雌核的染色体和一套雄核的染色体而成为三倍体。如果在正常受精卵处于第一次有丝分裂的中期抑制卵裂，即可获得四倍体。抑制第二极体的外排或抑制第一次有丝分裂，都可阻止纺锤丝或细胞隔膜的形成。

 4.2 人工诱导鱼类三倍体的方法

 人工诱导鱼类三倍体的方法很多，概括起来有物理学方法、化学方法、生物学方法等．

 4.2．1 物理学方法

 鱼类受精卵的物理学处理方法已被广泛地用来抑制第二次成熟分裂而获得三倍体。主要有温度处理、静水压处理、电休克和高盐高碱法等，温度处理和静水压处理效果较好，是目前人工诱导三倍体最常用的物理学方法。

 4．2．1.1 温度处理 又称温度休克，包括热休克和冷休克，一般用略高于或略低于致死温度来诱导三倍体．其作用机制是温度的变化引起细胞内酶构型的改变，不利于酶促反应的进行，导致细胞分裂时形成纺锤体所需的ATP 的供应途径受阻。使已完成染色体加倍的细胞不能分裂．温度休克的关键是开始处理时间、处理的持续时间以及温度的高低．一般来讲，温度休克敏感性与遗传背景和卵子的成熟度有关．为了加强刺激强度，冷水性鱼类宜用热休克，温水性鱼类宜用冷休克，温度范围不可超过该鱼致死温度，最好选用其亚致死温度进行短期处理。swarup(1959)报道了采用受精3min 后的三棘刺鱼卵，0℃休克1.5—3h ，结果获得三倍体，而且饲养至性成熟[5] 。Ojima 等报道对受精10min 后的鲤鱼卵采用0℃休克10min ，结果获得三倍体成鱼。尤锋(1993)曾进行单因子梯度实验及正交试验，并作方差分析获得了 黑鲷冷休克处理最佳诱导条件为受精后5min 用4—5℃水处理10—15min ，培育水温为17-20℃，若延长处理时间，则孵化率下降[7]。而Peter F 等在诱导溪鳟三倍体是则采用28℃的休克温度在其受精后10min ，持续10min ，结果得到98％ 一100％的三倍体，相对存活率达到42％ 一100％[8]。温度处理所需条件、设备简单，处理量大，但诱导率低，而且死亡率较高．所以温度休克方法在批量生产上不是很实际，推广有一定的难度，不过作为一种诱导三倍体的方法还是值得研究．

4.2．1．2 静水压法即利用专门的静水压设备产生较高的静水压(一般为650kg ／cm ) 施加于处理对象。其作用机制是抑制纺锤体的微丝和微管的形成，阻止染色体的移动，从而抑制细胞的分裂，形成多倍体。用静水压法处理诱导鱼类多倍体的作用效果主要受处理时间、压力强度、处理持续时间影响。以水晶彩鲫为例，受精卵的压力敏感期仅仅在受精后4—5min ，在此之前为卵子启动期，施加压力会破坏卵子的激动和修整过程。造成发育受阻，其后为压力不应期，此时第二次减数分裂趋于明朗，压力对保留第二极体失去作用．因此为了获得水晶彩鲫三倍体，静水压诱导只能在受精后4—5min 进行[9]。我国楼允东等用静水压诱导杂合二倍体雌核发育与三倍体虹鳟也获得成功，国外近几年采用静水压诱导三倍体较多[10]。LinhartO 等在欧洲鲶鱼受精后3min 以600kg ／cm 的压力持续4min ，结果得到97．8％ ±1．8％三倍体胚胎。存活率为33．7％ ±16．9％。虽然静水压法需要专门的设备如水压机，成本较高，样本室容量小，处理卵数不多，不适于大规模生产．但是其处理的最佳条件易于掌握，处理程序易于标准化，对受精卵的损伤比温度处理小，诱导率高，因而广受众多学者的青睐，是进行三倍体诱导的有效方法．

 4.2．1．3 电休克法Teskeredjic 等在1993年用热休克与电休克相结合的方法诱导银大麻哈鱼三倍体获得成功．他们发现交流电(AC)诱导三倍体比直流电(DC)更有效．将受精后40min 的卵置于26℃并给以10rain 的交流电休克可得到100％ 的三倍体，而直流电休克和只有热休克而无电流休克处理的对照组分别为7O ％和15％ ，交流电和直流电的电压皆为10V 。

 4.2．2 化学方法

 化学方法主要是利用一些能够抑制细胞分裂的化学物质．来干扰细胞正常的分裂过程，阻止第二极体的排出或受精卵的有丝分裂而产生三倍体或四倍体．主要的诱导剂有以下几种。

 (1)细胞松弛素B(简称CB) ．细胞松弛素是真菌类某些菌种的代谢产物，其中细胞松弛素B 用途最广。CB 对于活细胞具有干扰细胞质分裂的特殊效应，如细胞骨架的变化、多核化、破坏微丝等。一般认为CB 特异性破坏微丝，最终导致细胞分裂由微丝构成的收缩环解体，抑制细胞质分裂。阻止极体的释放，从而产生多倍体。CB 处理虽然成功率较高，而且可以诱导产生高比例的三倍体，但毒性较大，且有致癌性，水溶性较差，价格昂贵，不适合生产。CB 一般溶解在0．1％ 的二甲基亚砜(DMSO)中，而且处理结束后需用含DMSO 的海水浸洗受精卵，去除残留的CB 。

（2)秋水仙素．秋水仙索是从秋水仙器官中提取的一种植物碱，极毒，它能抑制微管的组装，使已的微管解聚从而阻止纺锤体的形成或破坏已形成的纺锤体，使细胞的染色体加倍而不分离．秋水仙素在植物中的应用较为广泛且成功，但在动物中应用较少，主要是动物细胞经过秋水仙索处理后容易形成育种实践上没有价值的镶嵌体且成活率较低．

 (3)6一二甲基氨基嘌呤(简称6一DMAP) ．6一DMAP 是一种蛋白激酶抑制剂，是影响磷酸激酶作用的嘌呤毒索类似物，通过作用与特定的酶，破坏微管的聚合中心，使微管不能形成，动而抑制极体的形成和释放．6一DMAP 与CB 相比诱导率相差无几。但其毒性弱，不具致癌性，水溶性较好，孵化率高于CB 处理，具有较好的应用前景，目前趋向于用它处理来达到大规模生产的目的。

 此外，聚乙二醇(PEG)、氯化钙、咖啡因等对抑制细胞分离，使染色体加倍也有一定的作用。必须指出的是化学诱导剂虽然诱导效果较好，但一般较贵，且具有毒性，再加上所诱导的多倍体往往是二倍体与四倍体的嵌合体而限制了它们的使用。

 4．2．3 生物学方法

 生物学方法主要有远缘杂交、核移植、细胞融合3种途径．尤其是远缘杂交报道的比较多．

 4．2．3．1 远缘杂交 异源精子可以诱发受精卵产生多倍体，这种由于远缘杂交染色体自然加倍产生异源三倍体或四倍体的现象，在理论与实践上均有重要意义．目前，国际科技界对杂交鱼三倍体工作甚为重视，其中研究最多的是鲑科鱼类杂交种和鲤科鱼类杂交种。Marian(1978)最早发现草鱼♀×鳙♂之间的杂种是异源三倍体。刘思阳(1987)也证实草鱼♀×三角鲂♂之间的杂种是异源三倍体，其中草鱼提供了两套染色体，三角鲂提供了一套染色体。种间杂交所产生三倍体的机理比较复杂，还有待于进一步的探索。

 4.2．3．2 核移植 细胞移植是应用显微操作，将一种动物的细胞核移人同种或异种动物的去核成熟卵内的方法。应用这一技术诱导鱼类多倍体目前还不太成熟。陆仁厚等(1982)用四倍体的草鱼培养细胞的细胞核作为供体移植到泥鳅的去核卵内，获得心跳期的四倍体胚胎．随着这一技术的逐步完善，将为诱导四倍体鱼类提供又一有效途径。

4．2．3．3 细胞融合 细胞融合指采用物理或化学的方法将2个或多个紧连的细胞融合成一个细胞。此种方法主要诱导鱼类囊胚细胞与囊胚细胞、囊胚细胞与未受精卵、囊胚细胞与受精卵或受精卵与受精卵之间的细胞融合。由于细胞内染色体发生重排，实际得到含各种不同数量染色体的鱼类细胞群，这一技术为探索改良品种提供了可能。

生物学方法除了以上三种直接途径外，还有一种间接途径：首先诱导获得四倍体，待四倍体个体成熟后再与二倍体个体自然交配，获得三倍体．从理论上讲。这一途径有其优越之处。一旦获得四倍体个体后，就不需要再进行物理或化学诱导，避免了诱导过程对胚胎的损伤。如果能建立稳定的四倍体品系，获得三倍体就变成了一件非常容易的事情了，但目前人工诱导的三倍体绝大部分是采用前面几种方法，这是因为阻止第二极体外排的方法比较成熟，四倍体的诱导是阻止第一次卵裂，这比诱导三倍体要困难得多，成功率很低，只在少数鱼类如虹鳟和获得过成熟的四倍体。

 5 细胞工程育种

 细胞工程应用于鱼类研究起步于20世纪5O 年代末60年代初，在20世纪7O ，8O 年代有了较大发展。主要包括鱼类细胞核移植、细胞融合以及细胞培养等。

 5．1细胞核移植：是一种将细胞核移植到另一细胞的细胞质中的生物技术，是一种高难度的，显微操作技术。20世纪5O 年代初由美国学者BRIGGS 和KING 首创。1963年，我国著名生

 物学家童第周建立了鱼类细胞核移植技术。其原理是在解剖显微镜下使用微量注射器把一种鱼的受精卵(发育至囊胚期) 一个细胞注射到另一种鱼的去核卵细胞中，得到核杂交个体。细胞核移植的操作主要有供体和受体的准备、去卵膜、挑去卵核、分离囊胚细胞和移核等程序。由于核移植技术能把不同的细胞核与细胞质鱼组在一起，创造新的个体。20世纪7O 年代后，细胞核移植技术开始应用于育种实践。但并非所有核质杂交种都可以培育成新品种，也不是所有的核质杂交种都有受体物种的性状，更不是所有的种间杂交屏障都可以借助细胞核移植技术来突破，因此，该技术应用于水产生物的育种还有大量工作需要完成。

 5．2细胞融合：是将两个不同遗传性状和遗传 背景的细胞合并为1个杂种细胞的技术，是在细胞与组织培养基础上发展起来的细胞杂交技术。我国于20世纪70年代初期开始进行这方面研究。利用电融合技术将细胞与鱼类未受精卵融合，获得细胞融合鱼是细胞工程育种一大进展；应用细胞融合和杂交瘤技术相结合，目前在鱼类上已获得了几种单克隆抗体；动物体细胞融合后，杂种细胞难以发育再生为一个个体，但借助于细胞核移植的方法将融合后杂种细胞的细胞核移人去核成熟卵内，培育新的杂种。因此，利用融合技术与移核技术相结合也有

可能创造出鱼类新品种。

 5．3细胞与组织培养：细胞与组织培养是把生物的细胞或组织在适当培养基里培养、传代、再生或快速繁殖鱼类的育种技术。水产动物细胞培养的研究起始于鱼类，已有30多年历史，目前已有61个鱼类细胞株相继建成，它们来自硬骨鱼类17个科36个种的各种组织，其中大多来自淡水鱼类或溯河涧游鱼类。我国鱼类细胞培养研究始于20世纪70年代，至今已获得草鱼吻端组织细胞株ZC-7901，草鱼尾鳍组织四倍体细胞株、鲫鱼异倍体细胞系CAB 一80，草鱼肾组织细胞系CIK ，草鱼尾鳍组织二倍体细胞系GCC ，硬头鳟巨噬细胞株、南方鲶鱼上皮型细胞系等。鱼类细胞培养与细胞核移植结合使用，在良种培养中起着重要作用。我国学者把鲫鱼胚胎的继代培养细胞核转移到鲫鱼的未受精去核卵中，培养出世界上第1尾无性繁殖鱼。

5．4嵌合体制作：嵌合体制作是将具有不同遗传背景的两种胚胎细胞混合起来，获得具有两者各自特征的个体的技术，也可称为细胞群移植法。此技术不同于细胞融合。通过嵌合体制作技术，人们已经获得了大、小鼠等一些哺乳动物的嵌合体。利用制作嵌合体的方法，即使在不能杂交的动物之间，也可获得具有双亲优良品质的动物。鱼类已有培育嵌合体的尝试，主要是通过胚胎融合和细胞群移植方法来实现。融合法是除去卵膜后，在囊胚期用细玻璃针将胚盘的一部分刺伤，将另一种鱼类胚胎胚盘细胞块移植过来，使两者融合发育成嵌合体。细胞群移植法是将一个胚盘分离出的细胞吸人毛细管中注射到另一胚盘的内部，由此发育成嵌合体。

 6 转基因技术及其在鱼类育种中的作用

 6．1转基因技术的一般方法

 6．1．1核期胚胎的显微注射法(M icrojection)该法由美国人Gordon [15]发明，其主要步骤包括：① 分离、克隆和重组外源基因，构建载体；② 将融合基因注入受精卵的原核(一般是雄原核) ；③ 将微注射后的受精卵移入假孕母畜的输卵管继续发育。1982年Palmiter 等[16] 将带有小鼠金属硫蛋白I 基因启动子的大鼠生长激素基因导入小鼠的受精卵，获得“巨型小鼠”，在生命科学领域引起了不小的轰动。按照转基因小鼠的思路，转基因兔、转基因绵羊、转基因猪、转基因山羊都相继成功。显微注射方法相对简单，整合率高，是目前应用比较广泛，效果比较稳定的制作转基因动物的方法之一。但该方法的整合位点随机，整合一般是多拷贝首尾串联相接，不利于研究基因的结构、功能及表达调控。

 6．1．2 逆转录病毒载体法

 6．1．2．1 逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎该方法主要利用逆转录病毒的长末端重复序列(1ong terminal repeats，LTRs) 区域具有转录启动子活性以及逆转录病毒可以直接整合到宿主染色体上的特点，将外源基因连接到LTRs 下部，构建重组载体，直接感染受精卵或微注入囊胚腔中．达到外源基因在宿主染色体上的整合，表达。Salter 等[17]用禽白血病病毒感染早期的鸡胚胎制作了转基因鸡，Haskell 等[18]应用该方法制作了转基因牛。

 6．1．2．2 逆转录病毒载体注射M Ⅱ期的卵母细胞

 1998年，Anthony 等对逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎的方法进行了改进。他认为逆转录病毒载体介导的基因整合的关键在于细胞分裂时出现核膜分解。有丝分裂时核膜降解的时间很短．细胞分裂完成后，核膜很快重新形成。而处于减数分裂中期(M Ⅱ) 的卵母细胞无核膜的时间远长于处于有丝分裂M 期的细胞。这为逆转录病毒载体介导的基因插入提供了更大的可能性。研究者利用该方法生产出了4头转乙肝表面抗原基因牛，外源基因在宿主基因组中整合的成功率为1O0％ 。逆转录病毒载体法导入外源基因的感染率高，宿主范围广，而且最重要的是外源基因在宿主染色体上以单拷贝整合，有利于研究基因的结构、功能及表达调控。目前，这一特性已被广泛应用于基因定位整合等方面的研究中。

 6．1．3 精子载体法

 该方法由Braekett 最早提出，其要点是精子直接与外源DNA 混合培养，外源基因可

以进入精子头部，受精后能发育成转基因动物。该方法简单，但其整合率低，已采用脂质体包埋法对其进行了改进。其改进方法是将外源DNA 在与精子共同孵育之前用脂质体包埋，脂质体与DNA 相互作用形成脂质体一DNA 复合体。这种复合体借静电作用吸附于精子表面，与细胞膜融合，将外源基因导入细胞并获得表达[21]。这二种方法都是通过人工授精将外源DNA 导入卵母细胞，产生转基因动物。Anthony 等[22]尝试了一种新方法：预先将小鼠精子进行破膜处理，再与外源基因共孵育1 min，然后将精子的头部显微注入M Ⅱ期的小鼠卵母细胞，在出生的后代小鼠中转基因阳性率可达20% 以上。该项研究揭示，精子膜破损后外源DNA 穿过外膜吸附于内膜，更有益于转基因动物的获得。

 6．1．4 体细胞核移植技术

 世界首例体细胞核移植哺乳动物—— 克隆羊Dolly 的诞生，是转基因动物研究史上的又一重大突破。1997年英国PPI 公司与罗丝林研究所的科学家联手通过体细胞核移植技术制作了转基因绵羊 。研究者们用人凝血因子IX 基因和新霉素抗性基因共同转导绵羊胎LX 成纤维细胞，然后用G4l8筛选和DNA 杂交的方法鉴定其中同时整合了上述两个基因的细胞，以同时整合了两个基因的绵羊胎儿成纤维细胞作核供体，获得了3只转基因绵羊。Alexander 等用非转基因母羊与转基因公羊精子人工授精后怀孕40天的胎儿成纤维细胞作核供体，获得了3只转人抗胰蛋白酶基因的奶山羊。毫无疑问体细胞核移植技术可以实现转基因的目的，并且出生的后代个体1O0 为转基因个体。这是因为用作核供体的细胞是确证整合了某一外源结构基因的细胞．一旦核移植成功，就意味着得到了转基因动物。

 6．1．5 胚胎干细胞介导的基因转移

 胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells ，ES 细胞) 是动物早期胚胎(桑葚胚或囊胚) 或原始生殖细胞(Primordial Germ Cells，PGCs) 在体外经分化抑制培养并传代而筛选出来的具有发育全能性的细胞。ES 细胞具有与早期胚胎细胞相似的高度分化潜能，当被注入囊胚腔后可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成。将目的基因转移入ES 细胞重新导入囊胚或经筛选后对转入外源基因的ES 细胞进行克隆，可培育转基因个体。目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。

 6．2转基因技术在鱼类育种上的应用

 20世纪70年代，基因克隆技术和重组DNA 技术的诞生为基因工程育种提供了理论基础和技术条件，使利用基因转移技术培育出动物新品种成为可能。70年代中期，国外科学家已从生理学和生物化学方面对某些激素和功能蛋白进行了研究，到80年代获得了应用于鱼类育种研究的一些项目的基因技术。以鱼类作为转基因育种的研究对象有许多有利因素，鱼类的遗传可塑性较大，不同种属、亚种之间的亲合协调都较容易 ；鱼类的怀卵量大，受精卵易得，且胚胎发育快，对受精卵的显微操作也比较方便 。1985年，朱作言等人将小鼠重金属螯合蛋白基因启动与调控顺序和人生长激素基因的重组DNA 注射到鱼的受精卵原核内，培育出生长速度快的转基因鱼(transgenic fish)，从而证明了外源基因可以在受体鱼内整合、表达、促生长，并通过性腺传递给子代，建立了一个完整的转基因鱼模型。由此证实了基因工程在鱼类育种上的可行性。研究者们采用显微注射法、精子载体法、电穿孔法等将外源基因送人受体细胞中，外源基因在受体细胞中经整合进入受体基因组中，并能表达生物学效应，传递给后代，可得到遗传稳定的转基因鱼种。我国是世界上第一个培养出转基因鱼的国家，鱼类转基因技术的研究目的是为了培育出抗病力强、生长速度快、能抵御恶劣环境的优良新品种。

 6.3、鱼类抗病性育种研究

 人工养殖鱼类常处在密集的环境条件下，因此易发疾病，成活率低，生产经营风险性大。近几十年来，随着科学养鱼水准的提高，家养鱼类的细菌性疾病基本上能得到控制，但对病

毒性疾病缺乏有效防治手段。基因工程育种的兴起，有可能选育出抗病力强的品系，如草鱼生长快，肉质鲜美，是人们普遍喜食的鱼类；但草鱼在饲养中易患肠炎、烂鳃、出血病，严重地影响产量。而在相同环境条件下鲤鱼很少患病，可以认为鲤鱼体内含有较强的抗病基因。 1997年，章怀云等[33]将红鲤总DNA 导人草鱼受精卵，获得了体形、体色均变异的个体。后来又有人进行了人α一干扰素对草鱼出血病抗性作用的研究，在此基础上，章怀云等将人α一干扰素基因导人草鱼受精卵，以期获得抗病强的转基因草鱼 。1998年，王铁辉等将团头鲂总DNA 导人草鱼受精卵中，获得了抗病能力强的子代。由于鱼类的许多遗传性状是由多个基因控制的，是一个协同表达系统，采用总DNA 转移法对培育抗病性能强的新品种具有一定意义，但是由于总DN 使受体鱼呈现供体鱼的多种性状，从而为后代的选育增加了复杂性。随着DNA 重组技术的发展，人们可以进行单个基因的遗传操作。如，人类乳铁蛋白(hLF)是人类非特异免疫系统中的重要蛋白，具有抑菌、杀菌和提高机体抵抗病毒的能力 ；国外已报道过转hLF 基因烟草的抗病作用研究，钟家玉等 将线性化的人类乳铁蛋白与鲤鱼β一肌动蛋白基因启动子构建的重组基因质粒，用电脉冲—— 精子介导转基因转移法，导人草鱼受精卵中，研究hLF 是否能提高鱼类的抗病毒能力。

 最近，Nam 引用病毒HRV 人工感染牙鲆，提取mRNA 建立cDNA 文库，与GenBank 已知序列基因比较，可见鱼类还存在许多未知的抗病毒基因。因此，研究鱼类病毒病的致病机理、自身抗病机制、克隆抗病基因、抗病基因的体外表达及抗病毒范围(如细胞抗病毒基因的表达产物、Mx 蛋白等) ，将有力地推动我国鱼类抗病毒育种的研究步伐 。

 6.4、转生长激素(GH)基因鱼的研究

 我国的鱼类基因工程育种研究从“非鱼”基因工程鱼开始，现已进入“全鱼”基因工程鱼研究阶段。

 6.4.1．“非鱼”基因工程鱼 这是指移人受体鱼内的外源生长激素(GH)不是鱼类的，而是其它动物的。如，最初使用的是人GH 基因，后来用鼠GH 基因、牛GH 基因；启动子最初为小鼠金属硫蛋白启动子，后来是RSV —LTR(劳斯肉瘤病毒— — 长末端重复序列) ，SV40(猿猴病毒) 。1990年，夏德全等 用小鼠MT 一1基因启动顺序与人生长激素(hGH)基因顺序重组的线性融合基因注射入团头鲂、鲤鱼的受精卵中，观察到了受精卵的变化及人生长激素基因的整合和表达，证明了人生长激素基因对受体鱼(团头鲂、鲤鱼) 有促生长效果；并证实了外源基因可通过性腺细胞传递给子代，对子代鱼亦有促生长效应。孙孝文等(1993，1995) 用显微注射的方法把牛、羊生长激素转入到鲤鱼的受精卵中，得到了同样的结果；他们用DNA 斑点杂交与southern Blot杂交技术检测了外源基因在受体鱼基因组中的整合，并建立了一套简单易行的显微技术，确立了外源基因导人鲤鱼受精卵的最佳时期。朱作言等将外源生长激素基因注入鲤鱼、银鲫等的受精卵中，发现外源生长激素基因在原肠胚时就有转录本出现，在受体鱼内能够合成基因产物。1995年，朱作言等对“非鱼”转基因红鲤鱼F ：代的食性进行了分析，发现它们所摄取的能量用于生长作用要高于非转基因鱼，饵料利用率高；后对其F 代研究发现，移植基因在体内存在分子多态性，与原代转基因鱼所用的外源基因相同的仅有18％ 。但赵浩斌等通过对肾细胞、尾鳍细胞进行核移植，能把极少量的外源基因长期地培养而不会丢失，这为获得同质化转基因鱼提供了一条有效的途径 。 “非鱼”转基因鱼的外源生长激素多为哺乳动物的生长激素，启动子多为病毒基因，这类转基因鱼的食用安全性让人担扰。闫学春等把转牛(羊) 生长激素基因的鲤鱼喂给猫吃，通过生理学、血液学指标、组织中的重金属含量及外源基因残存量的测定，结果表明，转基因鱼对猫不产生任何不良的影响[55] ；陈开健等用转人一α一干扰素基因的草鱼喂大鼠，3O 天后进行血液、组织等方面检查，亦未见对大鼠有影响，但长期食用是否会有影响尚待进一步研究 。许多“非鱼转基因鱼虽生长明显加快，但发现体内含外源生长激素高的并不是生长最快的鱼 ；有资料表明，鱼的启动子和结构基因重组的基因比哺乳动物相应的重组基因更有效地在鱼体内表达 引。因此科学家们希望建立一种“全鱼”转基因鱼种。我国已克隆，了多种鱼的生长激素基因及有关基因，构建了我国主要淡水鱼类的基因文库。沈孝宙已获得鲤鱼金属结合蛋白基因的启动子，最近朱作言又获得了具有调节功能的肌动蛋白基因启动子，成功地克隆了鲤鱼和草鱼的肌动蛋白基因、生长激素基因 为“全鱼”转基因鱼的育出提供了可能。

 6.4.2．“全鱼”基因工程鱼 中科院水生所培育出快速生长的“全鱼”转基因鲤，从遗传学和基因改造方面进行了食用安全性评价，被认为在营养安全方面与普遍鲤鱼具有实质等同性 .朱作言等(2002)[60] 成功地将鲤鱼B-肌动蛋白基因启动调控顺序(CA)驱动的gcGH 重组基因CAgcGH 移植到黄河鲤的受精卵中，大大地加快了黄河鲤的生长。此后，冯浩、曾志强等把含有鲤鱼B —action 基因启动子的草鱼生长激素基因“全鱼”基因pCAgcGHc 转入异源四倍体鲫、鲤体内，对其自交的F 。代进行了各方面的检测，发现转基因异源四倍体鲫、鲤中除了生长速度加快外，还可将“全鱼”基因pCAgcGHc 传递给后代。其后又将移入草鱼激素“全鱼”基因的异源四倍体鲫鲤(♂) 与日本白鲫(♀) 进行人工杂交，获得转基因三倍体湘云鲫，与普通的三倍体湘云鲫相比，降低了饵料系数，提高了养殖产量。黑龙江应用微生物研究所用显微注射法把鲤鱼生长激素移入到鲫鱼中，通过PCR 检测，外源基因在受体鱼基因中得到整合，表达出生长的生理效应，但其整合率较低。黑龙江水产研究所把黑龙江野鲤的MT 启动子和大麻哈鱼生长激素基因的融合基因导入到鲤鱼和虹鳟的受精卵中，研究外源全鱼基因对受体卵孵化率的影响。上述这些研究工作为尽快培育出快速生长的高产养殖品种积累了宝贵的资料。

 6.5转基因动物技术的研究及应用

 尽管转基因动物技术仍有许多需要完善的地方．但其研究的进展速度是异常迅猛的。近些年发展起来的基因剔除(gene knock out)技术具有整合位点确定、精确的优点，给转基因的定点整合或基因打靶(gene targeting)带来了希望。应用酵母人工染色体(yeast artificial chromosome．YAC) 技术．可以转移较大片段的基因，有利于保持转基因的天然组成和结构，因而有利于转基因功能的鉴定[64]。在融合基因的两侧加上基质附着区(matrix attachment region ，MAR) 的序列或“基因边界”(gene boundary) 成分，有利于外源基因。 表达。这些技术的完善，对于转基因效率的提高、转基因的定点整合等均具有重要的促进作用。

 7 鱼类种质检测

 鱼类新品种培育技术之间并不是互相孤立的，可以彼此互相结合，从而培育出优质、高产和抗逆的鱼类新品种。由于近代生物技术的发展，已能在染色体水平、细胞水平或分子水平上对鱼类进行遗传操作，但无论用何种方法进行遗传操作，最终都要经过鱼类种质检测这一步，这也是鱼类养殖和食用安全的前提。在鱼类养殖生产中，选择比较理想的养殖品种通常考虑的标准是：生长快速且体形较大、早熟且生殖力较强；其次是肉质好、抗病能力强以及养殖密度高、耐低氧等等。因而，鱼类种质的检测方法显得尤为重要。

 《养殖鱼类种质检测标准》是规范养殖鱼类种质质量的分析、检验、鉴定以及测试的一系列相关的技术标准。随着分子生物学的发展和水产品质量的更高要求，必须将新的生物技术分析手段运用到鱼类种质检验中来，以适应现代种质检验技术和生产发展的需要，补充和完善以往仅仅利用形态构造特征观察、经济性状测量、同工酶分析和染色体检测等常规方法来进行鱼类种质检验的技术标准。一般来讲，常规育种(如选育、引种、杂交等) 通常采用常规种质检验的技术标准，如生长性状检测法、血液指标检测法、同工酶检测法、染色体组型检测法等等；而高新技术育种(如航天育种、倍性育种、细胞工程育种、基因工程育种等) 除了运用常规种质检验的技术标准外，还需要采用高新技术的种质检验的技术标准，如功能蛋白(如生长激素、转铁蛋白、抗冻蛋白、抗寒蛋白、抗病蛋白等) 检测法、功能基因表达检

测法等，还可应用PCR ，RAPD 以及RFLP 等技术辅助检测。鱼类遗传育种中最为关键的是鱼类种质资源问题。我国鱼类种质资源丰富，为遗传育种研究提供了良好的条件和丰富的材料。但要开发利用好这些种质资源，从中选育出优良品种，首先必须保护好种质资源，收集原种，防止混杂；其次要弄清种质资源的遗传背景，建立鱼类种质资源保存技术；再次要建立并完善鱼类繁育体系；最后还要完善种质检测技术和鱼类种质标准制定。

 8 展望

 我国是水产养殖大国，拥有2000多年悠久的养鱼历史。我国鱼类遗传育种研究和水产品种的遗传改良工作已取得了令人鼓舞的成就和进展，同时也为今后的发展展示了美好的前景。但也要清醒地认识到，与先进国家相比有些方面仍存在着不足和差距。根据鱼类遗传育种发展的趋势和目前的研究现状，笔者认为今后研究的重要课题应该包括：从快速生长、增加抗性以及提高饲料利用率的角度进行的养殖鱼类品种改良；(2)鱼类养殖新品种的生态安全和食品安全研究；更加科学的鱼类养殖标准和检测标准的制定与完善；快速有效的鱼类种质检测方法的建立与完善；鱼类原良种体系和管理体制的建立和完善。生命科学的研究目的，是了解生命过程及其变化，疾病的发生、诊断和治疗，生物资源的保护、开发与利用。从达尔文到孟德尔，直至20世纪50年代，遗传学研究一直处于细胞水平；20世纪50年代以后，基因理论和中心法则的建立，以及DNA 结构的发现，使得遗传学研究跨入了分子水平；基因组计划的实施、转基因模型的建立以及胚胎干细胞技术的发展，使21世纪的遗传学研究进入了“基因组后时代”，将遗传与发育在基因水平上统一，为生物技术育种奠定了理论基础。育种技术的发展使人类对生物进行改造、推动物种进化，并最终为人类生产与生活服务成为可能。

(作者：现代畜牧科技  洪威)