医学蛭类与水蛭素：我国医学蛭类的种类特征和
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1 概述
蛭类动物在我国俗称蚂蟥、水蛭、马鳖等，全世界有六百余种，我国也有近百种。它们生活在淡水、潮湿的陆地以及海水里，作为暂时性体外寄生虫有的取食鱼、龟、鳖、蛙、水鸟以及像牛、马和人这样一些哺乳动物的血液，也有的取食蚯蚓、昆虫幼虫、虾、蟹和螺、蚌之类的无脊椎动物的体液、组织以致整个身体。我国对蛭类动物的记载早在公元前2世纪汉朝初期的《尔雅》中已经出现，对水蛭的应用在《神农本草经》中记述较为详细，谓其“主逐恶血、瘀血、月闭、破血消积聚┅┅┅┅”。医圣张仲景（168-188）的《金匮玉幽经》里所谓“下血”即是抗凝血的“破血”作用，由此可见我国早在公元2世纪便已发现水蛭的抗凝血功能了，这比西方国家利用水蛭的历史要早千年以上。到15世纪我国明朝李时珍著的《本草纲目》中则对水蛭在内科方面的药效作了详细的说明，并列举出不少的民间处方，主要用来治疗女子月闭、跌打损伤、漏血不止以及产后血晕等症。古籍中还记载有把饥饿的蚂蟥装入竹筒扣在洗净的皮肤上，令其吸食脓血以治疗赤白丹肿以及将蚂蟥研成干粉末与其它中药配伍治疗跌打损伤等症。自梁代陶弘景《本草经集注》以后历代的《本草》中都认为中药用的蚂蟥是指吸哺乳动物血液的种类。不管是水蛭、草蛭、山蛭、泥蛭，在吸牛、马和人血这一点上是共同的，而且强调“用之当以小者为佳”。但是我国早期的文献不可能说清楚使用吸食哺乳动物血液的蚂蟥治病的道理，以致在现今的《中国药典》中仍然将不吸哺乳动物血液的宽体金线蛭（Whitmania pigra ）和尖细金线蛭（Whitmania acranulata ）列为规定的种类，用作传统中药材, 谓其功能是破血通经，消积散瘀，消肿解毒和堕胎。在第二届全国活血化瘀学术会议上，还笼统地将主要是宽体金线蛭的水蛭确定为35味活血化瘀中药之一，归属于“作用峻裂的破血药范畴”，这些都是缺乏科学依据的，也给水蛭的医药应用造成了很大的混乱。笔者曾对我国安徽亳州、河南禹州、四川成都荷花池和湖北蕲春几个主要中药材市场销售的水蛭以及近十种水蛭中成药的原料作了调查，发现这些全都是一种不吸哺乳动物血液，终身取食螺类，主要生活在我国山东、江苏、安徽和湖北广大湖区以及长江流域及其以北各地河滩与池塘里的宽体金线蛭，全国每年消耗数以十吨计的干品，不断地捕捉大大破坏了这个物种在自然界的资源分布，同时也是与我国古代《本草》中的记载以及现代生物医药研究成果不相符的。造成这种现状的原因在于我国中医药管理、研制和临床应用部门缺乏对蛭类动物生物学与生物化学的深入认识，不知道在动物分类学上是环节动物门一个纲的蛭类动物在我国就有近百个种，它们分属于不同的目、科和属，在形态结构、取食习性、生活环境以及体内所含生物活性物质的结构和功能方面都是十分不相同的。几个世纪以前西欧国家也开始使用水蛭治疗心血管病、神经系统病、炭疽、青光眼和乳突炎等病。18-19世纪医蛭吸血法在欧洲曾风行一时，随着科学的进步，这种带有迷信色彩的治疗方法才逐渐被放弃了。
近百余年来，随着西方国家首先对吸食哺乳动物血液的水蛭唾液腺分泌物的深入研究，人们又发现了它们在医疗临床上的许多新用途。1884年威尔士国家医学院海克拉夫特（J. B. Haycraft）首先发现吸血水蛭咽部具有的水溶性抗凝血物质。1904年雅各比（C. Jacoby ）将这种物质命名为“水蛭素”（Hirudin）。1955年德国马克沃德特（F. Markwardt）首次从吸血水蛭体内分离提取出较纯的水蛭素，此后对水蛭素的纯化和标准化技术日臻完善。迄今已有十多个国家公布了水蛭素研究的专利并有英国水蛭生物药物公司（Biopharm UK Ltd ）、美国水蛭公司（Leeches U.S.A. Ltd ）以及 美国Sigma 生化试剂公司等多家公司在销售不同纯度的天然水蛭素以及其它水蛭产品。研究表明水蛭素是已知最有效的天然凝血酶抑制剂，在治疗某些血液性疾病方面优于肝素，能够更有效地抑制凝血酶诱发的弥散性血管内凝血和静脉血栓形成，在处理诸如败血休克、动脉粥样硬化、脑血管梗塞、心血管病、眼科以及遗传性疾病等缺少抗凝血酶Ⅲ的病例方面显示出巨大的优越性，从而引起各国医药和生物学工作者的广泛重视。除此以外，各国科学家还在吸血水蛭唾液腺分泌物中发现了许多与吸食哺乳动物血液相关联的生物活性物质，如麻醉剂（Anaesthetic）、血管扩张剂（Vasodilator）、水蛭透明质酸酶（Hyaluronidase, HAse）、裂纤酶（Hementin）、前列腺素（Prostaglandins）、抗生素（Antibiotic）、安替斯塔辛（Antistasin）以及博待啉（Bdellins）和伊格啉（Eglins）等其它蛋白酶抑制剂。目前国际上是将吸食哺乳动物血液，其唾液腺分泌物中含有水蛭素等多种生物活性物质并且在医药上具有广阔应用情景的蛭类动物统称为医学蛭类。1986年至1990年先后在英国威尔士的斯旺西市、加拿大的多伦多市以及耶路撒冷召开了国际水蛭科学家学术讨论会，笔者应邀出席了其中两次会议并在会上发言介绍了我国蛭类动物研究概况。1990年至2003年先后六次在欧洲各地召开了包括医学蛭类在内的国际生物治疗学术讨论会。然而至今我国没有任何人报道过宽体金线蛭和尖细金线蛭体内含有以上任何生物活性物质，它们也不吸食哺乳动物的血液，所以在本书中笔者未将其归入医学蛭类的范围加以介绍。我国有着丰富的吸食哺乳动物血液，其唾液腺分泌物中含有水蛭素等多种生物活性物质并且在医药上具有广阔应用情景的医学蛭类有待我们去开发和利用，现将这些医学蛭类的种类特征和生态分布列述如下。
2 我国医学蛭类的种类特征和生态分布
蛭类动物（Hirudinea）在动物分类系统中与寡毛类动物（Oligochaeta）作为两个纲划归环节动物门（Annelida）的有环带亚门（Clitellata）。它们都具有环带，又都是雌雄同体动物并通过分泌容纳受精卵的卵茧（cocoon）繁殖后代，胚胎发生也相同，都缺少外骨骼和功能性的叶足。在蛭纲中较高等的类群都有恒定的体节数而且又都具有用作运动器官的尾吸盘，其中真蛭亚纲（Euhirudinea）是主要的类群。它们都有32个口后节，尾吸盘又都由7节组成，根据有无可伸缩的吻可以分成为吻蛭目（Rhynchobdellida）和无吻蛭目（Arhynchobdella）。在无吻蛭目中医蛭形亚目（Hirudiniformes）较低等，多数有发达的颚，每个完全体节通常5环或更少。笔者在本书中讨论的我国医学蛭类就属于医蛭形亚目医蛭科（Hirudinidae）中的医蛭属（Hirudo）和牛蛭属（Poecilobdella）以及山蛭科（Haemadipsidae）中的山蛭属（Haemadipsa）。根据笔者统计，目前我国已发现医蛭属2种、牛蛭属6种、山蛭属10种，它们在医药上都具有广阔应用情景，现将这3属医学蛭类主要种类的形态特征及其生态分布列述如下。
(一) 医蛭属Hirudo Linnaeus, 1758
体中型至大型，长度30-150 毫米。背面通常有纵行的条纹。头部背面有5对眼，甚明显。体表感觉乳突通常背面8列，腹面6列。节IX至XXIII 或XXIV为完全体节，每节5环相等。环带占据15环，位于X 至XIII 。体内嗉囊在节X 至XIX之间，每节各有一对大的初生侧盲囊和一对小的次生侧盲囊，末对最大并向后伸至节XXV。水生种类，已知全世界有17种，我国仅有2种，其区分见以下检索表。
医蛭属分种检索表
1（2） 背面黄白色纵纹宽阔，灰绿色的纵纹狭窄，腹侧各有一条很细的灰绿色的纵纹，
阴道囊狭长┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅日本医蛭Hirudo nipponia
2 (1) 背面冬青绿色纵带宽阔，淡绿色的纵纹狭窄，腹侧没有细长的纵纹，阴道囊卵
圆形┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅丽医蛭Hirudo pulchra
日本医蛭Hirudo nipponia Whitman, 1886 （图9-1）
身体狭长，略呈圆柱形，背腹稍扁平。体长30-60毫米；最大体宽4.0-8.5毫米；尾吸盘直径40-5.5毫米。头部背面有5对眼，大而明显，在节II-VI背侧排列成弧形。前3对各占一环；第3，4对相隔一环；第4，5对相隔2环。背面有5条黄白色的纵纹，以中间一条最宽和最长。黄白色的纵纹又将灰绿的底色隔成6道纵纹，以背中两条最宽阔，背侧的两对较细。腹面两侧缘，各有一条很细的灰绿色纵纹。雄性生殖孔位于第31/32环沟上，雌性生殖孔位于第36/37环沟上，两孔相隔5环。咽部有6条内纵褶，背中及腹侧各一对。阴道囊狭长。本种在我国分布很广，北起东北各省和内蒙古，西至四川和甘肃，南达台湾和广东，但以长江流域各地数量较多。广泛栖息于水田及其与之相通的沟渠、池塘和沼泽中，特别是常年积水或排水不良的沤田和坂心田中数量最多。在水田里多集中在四角或田边，也有钻进田埂泥土中的。每年11月底开始潜入深土中越冬，第二年3月下旬到4月上旬，当气温达到10-13℃时开始出土活动。在长江中、下游地区，当气温升至13-15℃时开始交配，约经一个月后开始产茧，再经过16-25天孵化，幼蛭即可以从茧中钻出。通常
图9-1 日本医蛭Hirudo nipponia Whitman, 1886 背面观全形图
an. 肛门；cs. 尾吸盘；eyes 眼；ggs. 灰绿色的纵纹；
sen. 体表感觉乳突；yws. 黄白色纵纹. (笔者图，1996)
（二） 牛蛭属Poecilobdella Blanchard, 1893
身体中等大小至大型，长度40-210毫米，体形粗壮。皮肤粗糙，前后端成网状或有许多疣状突起。体色艳丽，有线形色斑或条纹，具有绿色、褐色或淡红颜色。头部背面5对眼，排列如医蛭属。共有15个完全体节，各有5环，在节IX至XXIII之间。体节感觉器大而明显，是区分体节的标记。两生殖孔被5-9环隔开，分别位于节IX – XIII上。
牛蛭属分种检索表
1（5） 阴道短，总输卵管与其一起开口向外┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅2
2（3） 两生殖孔被7环隔开，雌生殖孔在节XIII的b1/b2上，尾吸盘直径等于体宽
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅棒纹`牛蛭Poecilobdella javanica
3（4） 两生殖孔被5环隔开，雌生殖孔在节XII的b5/b6上，尾吸盘直径小于体宽
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅菲牛蛭Poecilobdella manillensis
4（3） 两生殖孔被9环隔开，雌生殖孔在节XIII的b2/a2上，尾吸盘直径接近体宽
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅远孔牛蛭Poecilobdella similis
5（1） 阴道有长柄，总输卵管开口到远离盲囊的阴道管端，或直接开口到盲囊上 ┅6
6（7） 阴道柄几乎与盲囊及阴道管的长度相等，总输卵管开口到远离盲囊的阴道管端
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅颗粒牛蛭Poecilobdella granulosa
7（8） 阴道盲囊呈卵圆形，总输卵管直接开口到靠近阴道管的盲囊部位 ┅┅┅┅
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅湖北牛蛭Poecilobdella hubeiensis
8（7） 阴道盲囊呈棒槌形，总输卵管直接开口到远离阴道管的盲囊部位 ┅┅┅┅
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅南京牛蛭Poecilobdella nanjingensis
个体较大，体长40-113毫米或更长；最大体宽3..5 – 20毫米；尾吸盘直径3 – 14 毫米，明显小于体宽。身体狭长且扁平。活着时背面黄褐色或橄榄绿色，背中有一条不显著的兰灰色纵纹，体表皮肤体节感觉器大而明显。两生殖孔通常被5环隔开，雄生殖孔在XI的b5/b6上，雌生殖孔在节XII的b5/b6上。尾吸盘直径明显小于体宽。颚很大，两侧表面有排列成3或4纵列的唾液腺乳突，通常颚脊上约有150个锐利的齿。射精管粗大，呈纺锤形。精管膨腔短，呈圆球形并被一层疏松的腺体覆盖着。阴道短，没有
菲牛蛭 Poecilobdella manillensis (Lesson, 1842) (图9-2)
图9-2 菲牛蛭 Poecilobdella manillensis (Lesson, 1842)
a. 背面观全形图χ2；b. 雌性和雄性生殖系统ⅹ6
an. 肛门；cod. 总输卵管；cs. 尾吸盘；de. 射精管；eb. 射精球；ep. 贮精囊；
eyes 眼； ga. 蛋白腺；o. 卵巢；od. 输卵管； pr. 前列腺；sp. 侧中斑点；
sen. 体节感觉器；ss. 上缘斑点；vad. 阴道管； vc. 阴道盲囊；vd. 输精管。
（笔者图，1996）
棒纹牛蛭Poecilobdella javanica (Wahlberg，1855)（图9-3）
图9-3 棒纹牛蛭Poecilobdella javanica (Wahlberg，1855)
a. 背面观全形图χ1.5；b. 雌性和雄性生殖系统ⅹ4.5
an. 肛门；at. 精管膨腔；bas. 棒纹；cod. 总输卵管；cs. 尾吸盘；
de. 射精管；ep. 贮精囊；eyes 眼； ga. 蛋白腺；o. 卵巢；od.
输卵管；ps. 阴茎囊；sp. 侧中斑点；qs. 方形侧缘黑斑；sen. 体节
感觉器；te. 精巢；vad. 阴道管； vc. 阴道盲囊；vd. 输精管。
（a. 笔者图；b. 自宋大祥等，1978）
个体很大，体长60 – 170 毫米或更长，个别的可达225毫米；最大体宽为10 – 19 毫米；尾吸盘直径10 – 19 毫米，常常等于最大体宽。身体狭长且扁平。活着时体表颜色极为艳丽，背面橄榄绿或草绿色，偶尔橄榄棕色。背中自眼间区至肛门前，有一断裂为22根棒的黑褐色纵纹。两生殖孔通常被7环隔开，雄生殖孔在XI的b5/b6上，雌生殖孔在节XIII的b1/b2上。皮肤感觉器非常地大而明显，伸长并与体轴倾斜或成直角。皮肤成网状，特别是在身体的两端。尾吸盘很大，直径常常等于最大体宽的宽度。颚很大，两侧表面有排列成3或4纵列的唾液腺乳突，通常颚脊上约有100 - 140个锐利的齿。精管膨腔很短，具有比较宽的阴茎囊。阴道也短，没有柄，总输卵管与其一起开口向外。本种在我国云南西南部地区，如西双版纳等地广泛分布，栖息于水田及其与之相通的沟渠、池塘和沼泽中，数量众多。这些孽生地杂草丛生，水流缓慢或停滞。平时它们潜伏在草丛中，当人、畜下水产生水波时立即漂游而来并爬到人、畜身上吸血，直至饱食后离去。雨季本种牛蛭最为繁盛，而在干旱季节里则极少见到，通常潜伏在泥草里越冬。
（三） 山蛭属 Haemadipsa Tennent, 1859
身体小而细长，呈亚圆柱形，从尾吸盘至头部渐渐变细，大小与形状又随取食程度而改变，通常8 – 50毫米长。棋盘格形的皮肤，特别是在头部及尾吸盘上最明显。头部背面有5对大眼，分别位于第2、3、4、5、8环上或2、3、4、6、9环上，第4、5对眼被2环隔开。身体背面通常有纵纹及斑点。完全体节有5环。两生殖孔通常被5环（节XIb5/b6 和节 XIIb5/b6）隔开，但少数种可能被更多的环隔开。尾吸盘巨大，在其背侧与体部交界处有2或3对叶状的耳状突，腹面有许多明显的辐射肋。口内有3个非常高而明显的颚，但其上没有唾液腺乳突，具有锐利并弯曲排列的细齿。射精球不发达，呈梨形的精管膨腔小，其表面覆盖有疏松的腺体。阴道分成为狭窄的管部和大而呈圆柱形的盲囊。已知全世界有12种和8亚种，我国已发现9种和2亚种，主要分布在华南和西南一些潮湿的山林地区，其区分见以下检索表。
山蛭属分种检索表
1（2）在第3和第4眼之间几乎总被多角形小区隔开，尾吸盘腹面通常有辐射肋74 – 76
条┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅ 3
2（1）在第3和第4眼之间可以或不被多角形小区隔开，尾吸盘腹面通常有辐射肋71 –
73条 ┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅ 4
3（6）背部有3条黑色或暗褐色条纹，中央一条狭细，有时断裂或完全消失┅┅┅┅
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅森林山蛭Haemadipsa sylvestris
4（5）身体通常红褐色或橙色，具有黑色斑，背中有一条黄色或黄绿色条纹┅┅┅┅
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅斯里兰卡山蛭，模式亚种Haemadipsa zeylanica zeylanica
5（8）身体颜色通常易变，但褐色斑点图案不变，背中较暗的区域有一条黑色或褐色条纹┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅斯里兰卡山蛭，敏捷亚种Haemadipsa zeylanica agilis
6（7）背部有3条深褐色条纹，中央一条完整，贯穿前后 ┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅ 日本山蛭 Haemadipsa japonica
7（8）背中及两侧缘上方有3条黑褐色条纹，中央一条粗大 ┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅ 珠峰山蛭 Haemadipsa qomolangma
8（9）背中黄褐色带状区的边缘有由17对弧形线联结成的两条黑褐色条纹，中央尚有一
根细条纹┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅ 盐源山蛭 Haemadipsa yanyuanensis
9（10）背中宽阔的淡黄色带状区的边缘有的地方突向外侧区内，中央及其两侧有3条
较细的棕色条纹┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅ 海南山蛭 Haemadipsa hainana
10（11）背中较宽的浅色带状区两侧共有6条粗而直的黑色条纹，无中央条纹 ┅┅
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅ 天目山蛭 Haemadipsa tianmushana
11（12）背中宽阔的乳白色带状区共有5个条纹并在各节上有凸向外的斑块，中央一条
狭细 ┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅ 广川山蛭 Haemadipsa guangchuanensis
12（11）背中乳白色带状区无中央条纹，内背侧一对纵纹粗而直，外背侧一对纵纹细
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅ 盐边山蛭 Haemadipsa yanbianensis
身体短小，略呈圆柱形，前半部逐渐变得狭细。体长10 – 36毫米；最大体宽2 – 5毫米；尾吸盘直径2.0 – 4.5毫米。体色黄褐，背面有深褐色的纵纹3条，中央一条较粗并贯穿身体前后，腹侧没有两条纵纹。头部背面有5对排列成弧形的大眼，分别位于第2、3、4、5和8环的背侧，第3、4对眼常在连续的环上。完全体节各有5环，共有14节。雄生殖孔位于节XIb5/b6环沟上，雌生殖孔位于节XIIb5/b6环沟上，两孔相隔5环。肛门在最后一环与尾吸盘交界线上。尾吸盘腹面通常有74 – 76条辐射肋。贮精囊甚大，呈U 形来回折叠。阴道囊是一薄壁的葫芦形盲囊。本种在我国主要分布于云南西部及西南部（如西双版纳等地区）、四川西南部，以及台湾的山地。营陆地生活，栖息温暖、潮湿的山谷和坡地树林中，在高山围成的平坝地带最多，也见于池塘、溪沟的岸边和稻田田埂杂草丛以及竹林中，但决不在平原上活动，不水溪亦不会游泳。一般呈点状或块状分布，每平方米的杂草、石头、泥土范围内可以采集到上百条之多。平时潜伏在草丛根基部分，石缝内，苔藓或落叶与枯枝上。离人、畜1米远以外即能感觉得到，动作十分敏捷，雨天时更为活跃。在夏秋两季当早晨雾水多时或雨后也极为活跃，靠近中午或下午太阳暴晒时以及干旱季节里则极少出来活动。在5 – 9月的雨季里山蛭进行繁殖孳生，7月初可见到幼蛭，特别是8月初最多。每下一场雨即孵化出一批幼蛭，长约5 – 9 毫米，呈圆柱形，生长迅速。在10 月至次年3月的旱季里极少见到日本山蛭，通常从11月起在靠近积水的潮湿土里或石缝里蛰伏，次年4 – 5月才出蛰活动。
身体中等大小，呈圆锥形，背面隆起，腹面平坦。体长11 – 36毫米；最大体宽2.5 – 6毫米；尾吸盘直径2 – 6毫米。活体时背面棕色或灰褐色，有许多不规则的灰黑色或黑色斑点。背中有一条较宽的浅色的带状区，其两侧共有6条3对粗而直的黑色纵纹。背侧区色深，多黑褐色斑点。腹面有咖啡色的斑点或由斑点聚集成的斑块，腹侧有两对平行的棕色纵纹，腹中为一条狭窄的银白色区带。贮精囊在远离射精球的地方螺旋盘绕。阴道囊粗而短，前部有一狭窄的颈部。本种仅见于我国，广泛分布在华东、华中、华南以及西南一些潮湿的山地丛林里。先后在浙江天目山、湖北神农架、河南太行山和大别山的南麓、四川峨眉山和盐边县、广东高州县以及海南岛发现。栖息于海拔600 – 2200米山地温暖、潮湿、阴暗的原始森林、灌木丛、冷竹林、溪边草丛和草坡上，尤其以小道旁边和枯枝落叶中较多。活动季节一般在每年4月下旬够至9月中、下旬，但以6月下旬至8月中、下旬小雨、雨后或者晨露未干之前时数量最多，也极为活跃。夏季至秋初在石块下、枯枝落叶中、草丛和松土内以及地表丛生的苔藓中产茧。冬季仅
图9-4 日本山蛭 Haemadipsa japonica Whitman, 1886
a. 背面观全形图χ7；b.头部背面观 ⅹ10; c. 雌性和雄性生殖系统ⅹ10
an. 肛门；au. 耳状突；cs. 尾吸盘；cod. 总输卵管；de. 射精管；ds. 背感器；
eb. 射精球；ep. 贮精囊；eyes 眼；o. 卵巢；od. 输卵管；pr. 前列腺；
ps. 阴茎囊； st. 条纹；te. 精巢；va. 阴道囊； vad. 阴道管； vd. 输精管。
（a，c笔者图；b自宋大祥等，1978）
图9-5 天目山蛭 Haemadipsa tianmushana Song, 1977
a. 背面观全形图χ4.5；b. 雌性和雄性生殖系统ⅹ10
an. 肛门；au. 耳状突；cs. 尾吸盘；cod. 总输卵管； ds. 背感器；
ep. 贮精囊；eyes 眼；o. 卵巢；od. 输卵管；pr. 前列腺；ps.阴茎囊；
sp. 斑点；st. 条纹；te. 精巢；va. 阴道囊；vad. 阴道管； vd. 输精管。
（笔者图，1996）
3 医学蛭类的唾液腺分泌物及其活性成分
蛭类动物的消化系统都是由口、口腔、唾液腺、食道、嗉囊、肠、直肠和肛门等部分组成的，而所有吸血蛭类的口都开口在前吸盘的腹中，口内是一完全围绕咽的口腔部分，在口腔内通常有3个（或2个）呈三角形排列的肌肉性颚，在颚的脊缘上有几丁质或部分是钙质的单列齿，通常唾液腺开口在颚脊上的齿之间，但在牛蛭属中则开口在颚两侧分散着的乳突上。由辐射肌和横肌构成的颚能牢固地贴在哺乳动物或人的皮肤上，借助三条或两条环形锯一样的齿列往复地动作即可将皮肤割成“Y”形切口。当口腔后的肌肉
图9-6 日本医蛭 Hirudo nipponia 消化系统解剖图
a. 消化系统；b. 和 c. 颚及其附属器官
an. 肛门；cr. 嗉囊; cs. 尾吸盘；int. 肠；ja. 颚；mth. 口；
oe. 食道；rt. 直肠； salg. 唾液腺； wr. 纵褶。
（笔者图，1996）
(一) 水蛭素（Hirudin）
关于天然水蛭素的研究、报道和专利，
的头部和整个身体做材料的，经乙醇脱水，然后加丙酮沉淀等一系列的步骤而得到水蛭素粗制品的。1970年德国马克沃德特（F. Markwardt）采用乙醇分级沉淀、阳离子交换、凝胶过滤以及阴离子交换等步骤获得了水蛭素纯品。1985年沃尔斯曼（P. Walsmann）和马克沃德特改进了纯化方法，采用离子交换与亲合色谱相结合而获得了高纯度的水蛭素。1986年约翰尼斯（Johannes）等人报道了一种五步纯化法，其中使用了高效液相色谱新技术。根据前人的研究得知水蛭素是由65个氨基酸组成的低分子量多肽，其中谷氨酸和天门冬酰胺的含量较高，分子量为7000左右，含有三个二硫键。已分离鉴定出7种异构体。二硫键是决定其分子构型稳定性，保持高抗凝活性的关键。当二硫键被氧化或还原，或者分子发生了蛋白降解，则失去其抗凝活性。若水蛭素的羧基被酯化，或失去酸性的C-端氨基酸，也会失去与凝血酶结合的能力。水蛭素的等电点较低，在3.8 – 4.0之间。在室温下能长期稳定，而在70℃以下可以保持活性，干样也可以保存一年，在水中加入百里酚结晶亦能保存6个月，其热稳定性随pH值的减小而增加。水蛭素能被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶破坏，却不受血纤维蛋白溶酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶A 的影响。水蛭素通过阻塞凝血酶的底物结合基团致使凝血酶失去活性，处在特异空间部位的水蛭素自由羟基与凝血酶自由氨基通过静电引力而结合，产生的络合物在凝血酶保持活性的整个PH范围内不会解离。1970年德国马克沃德特首先报道了一种测定水蛭素含量的方法 - 凝血酶滴定法，即根据水蛭素与凝血酶反映速度快，在化学计量学上呈正相关关系，可以用抗凝血酶单位来表示水蛭素的含量，一个抗凝血酶单位(AT-U)是指在37℃下使1个国际单位的凝血酶失活所需的水蛭素量。一个抗凝血酶单位对应于0.1微克的纯水蛭素，一条成熟的吸血水蛭约含有285个抗凝血酶单位的水蛭素。由于水蛭素具有活性高、结构稳定、不易失活以及后期纯化成本低的优点，是开发抗凝、溶栓新药的理想原料。
（二）水蛭透明质酸酶（Hyaluronidase, HAse）
克劳德（Claude, 1937）首先报道了在医蛭提取液中有一种“扩散因子”，后来林克尔等人（Linker et al., 1960）证明这是一种透明质酸酶。由于能够专一水解透明质酸的内葡萄糖苷酸键，因此是一种内切 – β– 葡糖苷酸酶(endoglycuronidase)，只降解透明质酸而不降解其它粘多糖，活性能被10ˉ5mol/ LHg++ 完全抑制，但不被肝素抑制。不同于从哺乳动物和其它动物组织中提取出来的内切 – β– N乙酰氨基葡糖苷酸酶和从微生物体内提取出来的内切己糖胺酶。它是分子量为28500的单体蛋白质，在50℃以下稳定，催化作用的最适pH是5.5，最适温度是38℃，可溶于50%的硫酸铵溶液，在70%饱和度硫酸铵溶液中的溶解度最小，冻干制剂能保持活力许多个月。水蛭透明质酸酶的活力单位被定义为：在pH5.5和38℃的最适条件下，一小时内从透明质酸中释放1微克葡萄糖还原当量的还原糖所需的酶量。一个这样的单位大约相当于对从哺乳动物来源的透明质酸酶规定的国际单位的20倍，比活力规定为每毫克蛋白含有的单位数。赫斯特（Hirst, 1941）证实了水蛭透明质酸酶强有力的抗菌性能在于能溶解体内和体外细菌的多糖被膜并形成抗体。水蛭透明质酸酶能促进药物迅速穿透皮肤并在皮内扩散，在治疗血栓性疾病时不被肝素抑制，因而具有比哺乳动物来源的透明质酸酶更大的应用价值。芭格达萨萝娃（Bagdasarova, 1969）首先发现水蛭透明质酸酶在治疗青光眼（白内障）方面有很好的效果。英国人用其治疗心血管病，也取得了良好的效果。由于水蛭透明质酸酶能降解在细胞间起联系作用的粘多糖–透明质酸，如果将它与水蛭胶原酶一起使用则可以分散动物组织的细胞，便于挑取单个细胞进行分代培养或细胞克隆，这在生物工程中特别是细胞工程中应用很广泛并已成为眼科和整形医学中的有力工具。不像哺乳动物来源的透明质酸酶，水蛭透明质酸酶不能降解软骨素或硫酸软骨素，故可以在生物化学上用来原位鉴定透明质酸，研究滑液、HA – 纤维蛋白以及其它含HA分子的细胞间基质。
（三）前列腺素(Prostglandins)
俄罗斯国立莫斯科大学巴斯柯娃等人(Baskova et al., 1987)应用放射免疫方法从欧洲医蛭的头部和整个身体中检测出前列腺素并且是以6 – Keto – PGF (简称 6 – KF) 的前体形式出现，这是一种前列腺素转化成的产物，具有明显的抑制血小板聚集和抗动脉硬化的功能特性，副作用也小，而血小板聚集是引起动脉粥样硬化和心肌梗塞的主要起因。6 – KF 前体多为一个具有五碳环和两个双键侧链的二十碳脂肪酸（PGI2）,它能迅速转化为性能稳定的最终产物6 – KF，利用检测6 – KF的含量变化可以判断PGI2的含量以及消长变化。研究表明前列腺素是人体内分布最广，作用极大的一类生物活性物质,它通过对某些激素的调节来控制人体平滑肌的收缩、血液供应（血压）、神经传递、发炎反应、电解质出钠以及血液凝固等生理过程。在实际应用中可以作为消散血栓和抗动脉脉粥样硬化的药物，是制造一系列具有良好性能药物的原料。
（四）安逖斯塔辛（Antistasin）
美国费城宾夕法尼亚医院的生物化学家加西克等人（Gasic et al., 1983-1986）从一种墨西哥水蛭（Haementeria officinalis）的唾液腺中分离出来一种含有119个氨基酸的多肽，取名安逖斯塔辛（Antistasin，ATS）。无数动物的和离体的，用水蛭的以及重组体的安逖斯塔辛（rATS）做的实验证明ATS能通过抑制含有fxα因子的血清酶来阻止血液凝固以及动脉和静脉血栓形成，抑制培养的主动脉光滑肌增生，也能减少实验动物肿瘤细胞的扩散，使肿瘤细胞保持运动状态而无法聚集在一处。这样十分有利于肿瘤患者体内的免疫系统将肿瘤细胞各个击破。ATS还在免疫组织化学实验中常常用来发现含有fxα因子的恶性细胞一小细胞癌，是一种具有巨大治疗优势的fxα因子抑制剂。fxα因子是一种培养光滑肌细胞的促细胞分裂剂并且能造成从内皮细胞来的促细胞分裂剂的释放。在体内，这些影响可能是对内膜过度增生促成的主要因素，因此ATS有抑制从内膜细胞来的以及在培养中来的fxα因子的作用。在动物模型中已证明ATS的体内治疗半寿期在30小时以上，它是一种稳定的多肽抗凝剂。常用的抗凝剂肝素有较低的治疗学指数以及较高的出血危险，有可能危及血小板功能的安全并且对抗凝血酶Ⅲ缺乏症病人的治疗是无效的。重组体的安逖斯塔辛（rATS）在体内有长的治疗半寿期，不会因治疗剂量产生出血或影响出血时间。因此rATS是一种对正常止血有最小影响的有效血栓抑制剂。概括地说安逖斯塔辛（ATS）是一种有效的，实用的，具有出血性并发症最小危险的抗凝剂，至少有等于促红细胞生成素（erythropoietin, EPO）一样的商业价值。
4 医学蛭类化学感受器的特异性以及唾液腺分泌物的采集
蛭类动物为了取食、生殖和自身的防御必须不断地通过光、水波、化学物质及物理刺激来接受周围环境的信息，对每种信息又有相应的感觉结构。在水蛭身体中部体节上有由两极细胞构成的皮肤感器（sensillae），这种感器对微弱的水扰动和光刺激都非常敏感，可以发现和传导这些微弱刺激。水蛭对包括食物在内的种种化学刺激，特别是吸血种类对血液刺激的反应都局限于头部背唇及口部皮肤上的化学感受器(chemoreceptors)。所有的皮肤感受器都是通过神经系统的传导，使身体作出相关行为反应的。美国埃利奥特博士（Elliott,1987）发表了她用扫描和透射电子显微镜观察排列在欧洲医蛭头部及口部皮肤上化学感受器的结果。发现头部背唇皮肤上有大小不同的两类纽扣状的纤毛墩（mound），较大的一类直径约35微米，较小的一类直径约10微米，它们由具有均匀长度的多纤毛细胞组成，这与具有长鞭状纤毛和短硬纤毛的皮肤体节感器在形态和功能上都不相同。除了背唇皮肤上的纤毛墩以外，在口的内侧皮肤上还发现了一类由3一4根短棍棒状突起构成的结构，也起到化学感受器的作用。同时她发现了吸血水蛭对氯化钠和精氨酸的简单混合液有如对全血一样的作用，通过头部背唇及口部皮肤上的化学感受器引起取食反应。
图9-7 吸血水蛭化学感受器的扫描电子显微镜观察
1 日本医蛭头部背唇化学感受器扫描电镜图；2 日本医蛭纤毛感觉墩上的纤毛扫描电镜图；3 湖北牛蛭头部背唇化学感受器扫描电镜图；4 湖北牛蛭纤毛感觉墩上的纤毛扫描电镜图；5 日本医蛭口部内侧皮肤上的短棍棒状突起扫描电镜图；6 湖北牛蛭口部内侧皮肤上的短棍棒状突起扫描电镜图 （笔者图，2001）
(一) 扫描电子显微镜观察
为了弄清我国两属吸血水蛭化学感受器的特异性，笔者与武汉大学电子显微镜室的同事合作做了日本医蛭和湖北牛蛭头部背唇及口部皮肤的扫描电镜观察以及取食行为实验。扫描电镜观察结果证明我国两种吸血水蛭头部背唇皮肤上也有两类大小不等的纤毛感觉墩，呈带状排列，约150个左右，每个墩的中央是由长度均一的纤毛状突起构成的纽扣状结构，前者的纤毛较稠密，后者的纤毛较稀疏。较大的一类纤毛感觉墩在光学显微镜下不具色素斑点，而在扫描电镜下日本医蛭每纤毛感觉墩约有30根等长的纤毛，湖北牛蛭每纤毛感觉墩约有25根等长的纤毛，前者呈稠密的丛状，后者呈稀疏的环状（见照片图组I: 1, 2 和3，4）。在口部内侧皮肤上也有由3 – 4 根短棍棒状突起构成的结构，日本医蛭的突起呈密集丛生状，湖北牛蛭的突起呈稀疏丛生状（见照片图9-7: 5和6）。
（二） 取食行为实验
为了验证以上两种吸血水蛭化学感受器的分布位置与取食反应的关系，笔者特用两组小玻璃杯分别盛以新鲜的猪血和牛血，杯口蒙上肠系膜并将其投入内有两种饥饿吸血水蛭的缸中。重复多次之后发现日本医蛭头部背唇及口部皮肤对盛以新鲜猪血的小玻璃杯非常敏感并喜食猪血，湖北牛蛭头部背唇及口部皮肤对盛以新鲜牛血的小玻璃杯非常敏感并喜食牛血。同时又用经过手术切除头部背唇和口部皮肤以及只部分切开而不摘除头部背唇和口部皮肤的两种饥饿吸血水蛭做了以上实验，重复多次之后发现切除头部背唇和口部皮肤的个体对盛有新鲜猪血和牛血的小玻璃杯均无任何取食反应发生，然而部分切开又不摘除头部背唇和口部皮肤的个体对以上的小玻璃杯有与不切除头部背唇和口部皮肤的个体同样的取食反应发生。这进一步证明了两种吸血水蛭的化学感受器均分布在头部背唇和口部皮肤上。
（三） 吸血水蛭化学感受器的特异性以及唾液腺分泌物的采集
为了验证猪血和牛血中何种成分可以通过两种吸血水蛭化学感受器引起取食反应。笔者用三组小玻璃杯分别盛以哺乳动物血液中均含有的150mM氯化钠，1mM L精氨酸以及150 mM 氯化钠和1mM L精氨酸，杯口蒙上肠系膜并将其投入内有两种饥饿吸血水蛭的缸中。重复多次之后发现两种饥饿的吸血水蛭均对盛有150 mM 氯化钠和1mM L精氨酸的小玻璃杯非常感兴趣，有如取食血液一样地取食这种混合液。这种对哺乳动物血液中固有成分（氯化钠和精氨酸）必须浓度的选择性识别是专一的，这在引起起取食反应的过程中起决定作用。由于氯化钠和精氨酸都是以很高的浓度存在于哺乳动物血液和汗液中的，我们可以利用哺乳动物的血液和汗液在野外诱扑各种吸血水蛭，也可以利用必须浓度的氯化钠和精氨酸在室内从饥饿的活体吸血水蛭体内大量提取重要的心血管药物原料一医学蛭类唾液腺分泌物。一条饥饿的活体吸血水蛭可以反复使用6 – 7 次，这比用头部或整个身体匀浆后做生化提取、分离和纯化要节省大量的试剂、时间和金钱。吸血水蛭唾液腺分泌物大量提取技术的解决，将大大促进医学蛭类的药物开发和利用。
5 医学蛭类唾液腺分泌物活性成分的分离、纯化与活力测定
(一) 水蛭素的分离、纯化与活力测定
此段以我国产的日本医蛭为对象，先将其充分饥饿再采用以上唾液腺分泌物的采集方法大量提取唾液腺分泌物，置冰箱中冷冻保存待用。解冻后取250 – 300 ml加进4倍置冰箱中4℃下预冷的含15%水的冷丙酮，搅拌后置冰箱中4℃下让其沉淀过夜，次日吸出上清丙酮并离心，在所得沉淀中加入预冷的三氯乙酸（约25 ml）使其溶解，离心除去残渣，待上样进行柱层析。
阴离子交换柱层析 取适量二乙基氨基纤维素阴离子交换剂（DEAE-C52 ）加蒸馏水使其膨胀，按常规方法依次用0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L的HCl及 0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液各浸泡300分钟后用蒸馏水洗涤至中性。装柱（2cm x 60cm）至所需高度，用pH4.6的0.1mol/L 柠檬酸钠缓冲液平衡；用5ml的唾液腺分泌物浓缩液或上述三氯乙酸溶液上样进行梯度洗脱并用核酸蛋白检测仪记录绘制出洗脱曲线，分段收集洗脱液，流速为30ml/小时。经检测将有活力部分集中于透析袋中用甘油浓缩，再用双缩脲法测总蛋白质含量，继续以下凝胶过滤柱层析。
双缩脲法测总蛋白质含量 取一系列试管分别加进0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 的标准牛血清白蛋白溶液（6mg/ml）,用水补足至2ml，然后分别加进4ml的双缩脲试剂（每
升溶液中含1.50g CuSO4• 5H2O和 6.0gNaKC4H4O6• 4H2O, 30gNaOH)，在室温下放置30分钟，用721分光光度计在540nm处比色，光密度分别为0，0.066，0.135，0.210，0.285，0.340。以光密度为纵坐标，牛血清白蛋白（BSA）含量为横坐标绘出标准曲线。取2.0 ml于透析袋中用甘油浓缩后的样品按上述方法测540nm处的比色，便可以在标准曲线上查到对应的蛋白质含量的微克数。用测得的蛋白质含量结合用凝血酶滴定测得的数据，便可以求算出样品中水蛭素的比活力。日本医蛭唾液腺分泌物提取液纯化总得率为15%；纯化后的产物的比活力为6708 AT-U/mg 蛋白。
凝胶过滤柱层析 取适量的交联葡聚糖离子交换剂（SephadexG25）加蒸馏水浸泡4小时，按常规方法用0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 混合液浸泡半小时，抽滤除去硷液并用蒸馏水洗涤至中性，加热煮沸除去气泡。装柱（1.5cm x 50cm）至所需高度，用pH7.4的0.1mol/L Tris-HCl-NaCl缓冲液平衡，将上述有活力洗脱液的透析袋甘油浓缩液上样，洗脱并用核酸蛋白检测仪记录绘制出洗脱曲线，分段收集洗脱液，流速为90ml/小时。分别检测活力，将有活力部分集中于透析袋中用甘油浓缩。再检测活力后，待用DU-70贝克曼分光光度计在200nm至400nm波长范围内扫描，便能确定所得产物的纯度。
凝血酶滴定法检测水蛭素的含量 这是德国马克沃德特（Markwardt，1970）首先报道的一种测定水蛭素含量的方法，这种测定方法用得十分广泛，至今仍然被美国Sigma 生化试剂公司和英国水蛭生物药物公司作为标准测定方法而列入水蛭素的规格和价目表中。具体步骤是用微量进样器将50微升未知水蛭素含量的被测日本医蛭唾液腺分泌物提取液加至溶有0.5%牛血纤维蛋白原的200微升pH7.4的 0.1mol/L Tris-HCl-NaCl缓冲液中，混合均匀后在室温下以每分钟1微升的速度递次加入100抗凝单位/毫升标准凝血酶稀释液并及时搅拌，让其与牛血纤维蛋白原和未知水蛭素含量的被测溶液充分混合均匀，当在1分钟内出现胶冻状凝块时即为滴定终点。从滴定的凝血酶量，可以推算出被测溶液中水蛭素的活力单位。研究表明水蛭素与凝血酶之间相互作用的部位主要处于水蛭素分子的C端。测定结果表明日本医蛭唾液腺分泌物提取液中水蛭素的含量为4抗凝单位/毫升（AT-U/ ml）。凝血酶滴定法是一种简易、省时、准确、稳定的水蛭素活力测定方法，然而测定结果受到环境温度和凝血酶活力的影响很大，也受到操作人员对方法掌握的熟练程度的影响。气温太高或太低、凝血酶活力丧失以及试剂稀释不恰当均能造成测定结果的较大偏差，其最适温度范围应在25 -37℃之间。除此之外，还有分光光度法、光散射法和血纤维蛋白肽A 放射免疫法等几种方法可以采用，这里不加多写。
（二） 蛭透明质酸酶的分离、纯化与活力测定
通过硫酸铵分级沉淀进行酶的分离与纯化 分别取一定体积的日本医蛭和湖北牛蛭唾液腺分泌物提取液，缓慢加固体硫酸铵至40%饱和度，在冰浴中搅拌10分钟，并在700转/分钟下离心20分钟，取上清液调硫酸铵饱和度至80%，同上离心取沉淀，将此沉淀悬浮于10 ml pH7.0的70%饱和度硫酸铵溶液中，充分搅拌并同上离心取沉淀，溶于5 ml pH7.0的50%饱和度硫酸铵溶液中，同上离心取上清液，装入透析袋中对无离子水透析，直至用10% BaCl2检测无沉淀时终止，量取透析后液体体积，留适量用作测酶活及测蛋白质含量。整个过程采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法监测酶活。
通过二乙基氨基纤维素阴离子交换剂（DEAE-C52 ）柱层析进一步分离与纯化酶 将预处理的DEAE-C52装柱（1.5cm x 50cm），用pH7.1的0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液平衡过夜。上样后，待记录仪基线平稳后再依次用pH6.0的0.1 mol/L 柠檬酸缓冲液，pH5.6的0.1 mol/L 乙酸缓冲液（含0.1 mol/L NaCl）, pH4.0的0.1 mol/L 乙酸缓冲液（含0.2 mol/L NaCl）洗脱，流速为40ml/小时。测定结果表明pH5.6下的洗脱峰水蛭透明质酸酶（HAse）酶活力最高。将该峰的洗脱液装入透析袋中对无离子水透析，然后加入3倍体积的冷丙酮沉淀，最后将沉淀抽干置-20℃下保存。
制定葡萄糖标准曲线 用15℃下烘干到衡重的葡萄糖配制250微克/毫升的标准液，在成梯度容量的各标准液中加3毫升3，5-二硝基水杨酸(DNS),在沸水浴中5分钟显色后用自来水冷却至室温并加蒸馏水稀释。用72型分光光度计在550nm处测定光密度OD值 ,用OD550对葡萄糖微克数做标准曲线。
样品中酶活力的测定 在0.8 ml pH5.5的0.02 mol/L 柠檬酸缓冲液中加 0.2 ml 的5mg/ml透明质酸溶液和0.2 ml 待测样品于38℃水浴中精确保温30分钟，然后将试管浸入沸水中终止反应。取0.1 ml以上降解液加3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂显色，同时用0.2 ml煮沸的酶液作对照测A550（吸光率），根据光密度OD550从标准曲线上查出还原糖的微克数。每毫升样品中酶活力单位数（I.U./ml）= 还原糖在标准曲线上的微克数X 12。结果表明用常规糖定量3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测水蛭透明质酸酶（HAse）较传统浊度法更简单和可靠，灵敏性和专一性都较好。日本医蛭的产率为17.8%，湖北牛蛭的产率为14.3%。
用福林(Folin)-酚试剂法测蛋白质含量 首先按照常规方法测定吸光率A540，制定出牛血清蛋白(BSA)标准曲线。蛋白质含量(mg/ml) = A540 x 3.91,取1.0 ml样品按上法测A540便可以在标准曲线上查到对应的微克数。用测得的蛋白质含量可以推算出样品
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